研究背景心血管疾病严重威胁着人类健康,血管旁通路术和血管移植物置换是冠心病、周围血管病变的重要治疗手段。同样,头颈部恶性肿瘤发病率占全身恶性肿瘤发病率的6%,其中侵犯到颈动脉的病例屡见不鲜,肿瘤连同受累颈动脉的切除以及颈动脉重建被认为是一种较为理想的治疗方式。临床上常用的动脉移植体有两种,分别是自体静脉及以聚四氟乙烯（PTFE）为代表的人工血管。但由于自体静脉组织来源有限,人工血管惰性材料用于小口径动脉（直径＜6mm）时容易导致栓塞、内膜增生、感染等并发症,因此颈动脉等小口径动脉仍然缺乏一个理想的动脉移植体。此外,颈动脉身处频繁活动的颈部,具有很强的伸缩、柔韧性需求。寻求一种能够充分内皮化、且高效再生肌性管壁的颈动脉移植体对头颈外科而言具有十分重要的意义。具有内皮、平滑肌再生潜能的“重塑性移植体”正在成为小口径血管移植体的重要研发方向。血管移植体体内重塑过程需要动员大量的干细胞,并使之向功能细胞高效分化。动脉壁中存在一种独特的组织驻留干细胞——血管前体细胞（VPCs）,它具有多向分化的功能,能够分化成为内皮细胞、平滑肌细胞、血管周细胞等重要血管构成成分。大量研究通过优化材料成分、微观结构,期望促进血管前体细胞募集,加速内皮化和功能基质再生。但长期以来,重塑性移植体再生小口径血管的效果并不理想,主要原因之一在于材料引发的持续炎症制约了功能性细胞的募集。近年来,随着免疫细胞调控机体修复及再生机制的深入研究,组织固有巨噬细胞的重要调节作用逐渐被揭示。“组织固有巨噬细胞-前体细胞”相互作用是影响再生进程的关键环节。如果我们能够阐明宿主组织对血管移植体免疫反应的关键机制,进而调控移植体周围免疫反应,则有可能加速内源性干细胞的募集并促进功能性血管细胞分化,从而再生出具有理想结构的颈动脉组织。在前期研究中,我们构建了内层高度多孔的癸二酸甘油酯（PGS）/外层聚已内酯（PCL）超薄纺丝的双层人工血管,PGS快速降解缓解了慢性炎症,超薄PCL纺丝层引导贯穿式细胞募集,从而在年轻（2-3月龄）大鼠体内实现了血管移植体（内径1mm）的快速重塑。然而,对PGS/PCL这种重塑性血管移植体而言,它的体内重建极度依赖于宿主自身的再生潜能。当机体衰老时,宿主炎症反应增强、再生与修复机能受损,重塑性移植体体内功能性细胞募集及组织改建会受到极大的制约。生物因子负载是提高聚合物移植体血管再生的有效手段。胸腺素β4（Tβ4）是一种具有免疫调节功能的促血管生成多肽,且二聚体形式存在胸腺素β4（DTβ4）具有更强的生物活性。研究目的我们尝试用胸腺素β4二聚体（DTβ4）及PGS/PCL双层血管移植体构建出具有免疫调节性且再生功能优化的小口径动脉移植体,并对DTβ4负载的动脉移植体体内重塑机制进行研究。研究方法本研究主要包括四部分实验。实验一,通过构建移植体屏障及移植体表面荧光脂肪移植披覆实验,明确PGS/PCL血管移植体体内改建的主要细胞来源。实验二,采用静电混纺技术将负载DTβ4的胶原纺丝与PCL混纺,在内层PGS多孔弹性支架外周构建出免疫活性多肽DTβ4负载的PCL-Col（胶原）混纺的纳米纺丝鞘层,并对其结构参数及多肽负载效率进行表征。实验三,将分别载有PBS,Tβ4和DTβ4的PGS/PCL-Col血管移植体植入衰老大鼠（18-24月龄）腹主动脉,分别于2周、4周、12周取材,通过组织学染色和生物化学分析方法,明确DTβ4对移植体体内巨噬细胞极化状态、血管前体细胞募集状态及血管移植体肌性重塑的影响。随后,将巨噬细胞接种于DTβ4负载支架材料,并与Sca-1+血管前体细胞进行共培养,进一步明确材料诱导作用下M2型极化的巨噬细胞与Sca-1+血管前体细胞之间相互作用机制。最后,在氯膦酸脂质体注射敲除腹主动脉血管周脂肪组织中巨噬细胞的基础上,将DTβ4负载血管移植体植入衰老大鼠腹主动脉,验证血管周脂肪组织来源的巨噬细胞在移植体肌性重塑中的关键作用。实验四,将载有PBS,DTβ4及DTβ4+3-MA的PGS/PCL-Col血管移植体植入衰老大鼠颈动脉,于2周后取材,检测三组移植体的通畅率,并通过组织学染色和生物化学分析方法,观察三组移植体Sca-1+细胞募集状态、自噬水平及移植体内皮化情况。同时,体外提取血管周脂肪来源的Sca-1+VPCs与载有PBS,DTβ4及DTβ4+3-MA的三组支架材料共培养,通过TEM、WB、免疫荧光染色观察Sca-1+细胞的自噬水平、迁移及分化状态的变化。最后,在将DTβ4负载的PGS/PCL-Col血管移植体植入颈动脉缺损模型的基础上,进行自体血管周脂肪结缔组织移植,观察分析自体血管周脂肪移植对血管移植体短期体内改建的影响。研究结果将DTβ4负载于PGS多孔支架外周的PCL-Col纳米纤维鞘层中后,DTβ4在调节新生动脉三层结构（内皮,平滑肌中层,外膜）的再生过程中均起着重要的促进作用。血管周围脂肪组织（PVAT）为血管前体细胞的重要来源,当受DTβ4刺激时,来源于PVAT的Sca-1阳性VPCs迁移并分化为平滑肌和内皮细胞参与移植体体内重建。在DTβ4作用下,巨噬细胞极化为M2型并通过旁分泌PDGF-BB进一步促进Sca-1阳性VPCs肌向分化,使衰老动物肌肉重塑效果得到明显改善。此外,DTβ4通过调节自噬激活Sca-1阳性VPCs的迁移及内皮向分化,有效改善了衰老动物颈动脉移植体通畅与快速内皮化。研究结论与Tβ4相比,DTβ4载入高强度PCL鞘层时显示出增强的血管再生活性,解决了由衰老引发的血管再生缺陷问题,为小口径血管移植体的临床转化提供了合理的改良策略。