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背景:肺动脉高压(PAH)是以肺动脉压力和肺血管阻力持续升高为特点的一类致命性心血管疾病。缺氧等多种因素可引起肺动脉内皮细胞(PAEC)功能紊乱,引发肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖和肺血管重构,导致PAH的形成。MicroRNA(miRNA)是一类高度保守的小分子非编码RNA,通常在转录后水平负调控靶基因的表达,大量研究表明miRNA的异常表达与多种疾病的发生发展密切相关。随着研究的深入,人们发现细胞核和外泌体中也存在着成熟的miRNA。核miRNA因其特殊的定位而发挥不同的调控作用,如:转录基因的激活和沉默、抑制其他非编码RNA初始转录本的成熟等。核miRNA也已被证明与多种疾病相关,但在PAH领域尚无相关报道。外泌体miRNA作为一种信号分子参与了细胞通讯,实现了远距离靶向调控,也已被证明参与多种疾病包括PAH的发生,并且被研究作为一种潜在的诊断标志物和治疗手段。目的:绘制缺氧刺激下人肺动脉内皮细胞(HPAEC)和外泌体中的miRNA表达谱并筛选差异表达的miRNA;绘制HPAEC细胞核内的miRNA表达谱并筛选富集于细胞核内的miRNA,并对其进行初步功能研究。方法和结果:利用本实验室研发的高灵敏、特异的S-Poly(T)Plus miRNA检测技术,对缺氧与常氧条件下的原代HPAEC细胞中的650条miRNA进行了检测,剔除扩增不佳的一些miRNA,绘制出了剩余568个miRNA在常氧/缺氧处理的HPAEC中的表达谱。从初筛结果中,挑选了至少在2批样本中变化倍数≥1.5并且Ct值≤30的miRNA,在4批常氧/缺氧处理的HPAEC样本中再次通过qRT-PCR进行了单个验证,最后得到10个在缺氧刺激下表达量下调倍数在2倍以上的miRNA:miR-139-3p、miR-323a-5p、miR-572、miR-596、miR-663a、miR-1343-5p、miR-1913、miR-3196、miR-3960和miR-4497;3个在缺氧刺激下表达量上调倍数在2倍以上的miRNA:miR-210-3p、miR-424-5p和miR-503-5p。而针对HPAEC细胞核中miRNA的筛选,首先将HPAEC进行核质分离,对其进行质检确认细胞核RNA部分基本无细胞质RNA的污染后,在HPAEC细胞核中利用S-Poly(T)Plus miRNA检测技术检测了同样660个miRNA。汇总2批筛选结果,挑选在HPAEC核RNA中ΔCt值等于或小于它在HPAEC总RNA中ΔCt值的miRNA再次通过qRT-PCR进行单个验证最后得到可能富集于细胞核中的6个miRNA:miR-92b-5p、miR-1246、miR-1273f、miR-3960、miR-4466和miR-4508。对这些核miRNA进行了初步功能分析,发现miR-1246和miR-3960能促进HPAEC的血管生成能力,并且miR-1246还能促进HPAEC的迁移。动物实验表明,miR-92b-5p的表达量在MCT诱导的PAH大鼠的肺动脉组织中显著下调。对缺氧HPAEC外泌体中的miRNA进行了高通量测序,绘制了702个miRNA的表达图谱,发现miR-1246不仅在HPAEC核中富集,在其外泌体中也有表达;miR-210-3p表达量在缺氧HPAEC的细胞和外泌体中都上调。结论:本研究绘制了缺氧刺激下HPAEC、核和外泌体中的miRNA表达谱,并从中筛选出在缺氧HPAEC中表达量上调2倍以上(fold change≥2)的10个miRNA:miR-139-3p、miR-323a-5p、miR-572、miR-596、miR-663a、miR-1343-5p、miR-1913、miR-3196、miR-3960和miR-4497以及下调2倍以上(fold change≥2)的3个miRNA:miR-210-3p、miR-424-5p和miR-503-5p,其中miR-210-3p在缺氧HPAEC外泌体中表达量也显著上调;富集在HPAEC细胞核中的6个miRNA:miR-92b-5p、miR-1246、miR-1273f、miR-3960、miR-4466和miR-4508,其中miR-1246在HPAEC外泌体中也有表达,miR-1246和miR-3960能促进HPAEC的血管生成能力,并且miR-1246还能促进HPAEC的迁移,miR-92b-5p的表达量在MCT诱导的PAH大鼠的肺动脉组织中显著下调。