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猪源多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,P.multocida)是猪肺疫和猪萎缩性鼻炎的主要病原,能给生猪养殖行业造成重大经济损失,而通过接种疫苗是防控该病的一种重要手段。其中P.multocida荚膜血清型A型和D型是目前猪群中流行的优势血清型。本研究旨在通过对P.multocida多种候选保护性抗原,如外膜蛋白(ompA、ompH、olpB及oma P)、外膜脂蛋白(vacJ、plpP及plpE)、丝状血凝素蛋白(fhab2)、膜转运蛋白(transmembrane protein,Tmp)、TnoB依赖受体蛋白(Hgb、HgbA)、黏附因子(MapA)、及菌毛蛋白(ptfA),共13种候选保护性抗原所对应的基因进行分子流行病学调查,分析基因序列同源性以及在A、D血清型之间的分布规律,从而初步判断其免疫保护范围。后对筛选的保护性抗原基因进行质粒构建及原核表达,配制成疫苗后与弱毒疫苗及灭活疫苗同时免疫接种小鼠,先后通过滴鼻和腹腔注射攻毒的方式评估其对猪源多杀性巴氏杆菌的免疫保护效果。经分子流行病学调查发现omaP、Tmp、ompA、ompH、ptfA、olpB和Hgb等7种保护性抗原基因在92株P.multocida(A型50株,D型42株)中检出率为100%。而MapA、HgbA、plpE和fhab2等4种基因仅在A型菌株中检出,检出率分别为100%、49%、40%和42%。VacJ和plpP这两种基因在A型菌株中的检出率为85%和42%,在D型菌株中的检出率为100%。通过DNAstar软件对检出率高(100%)的基因及plpE基因测序和比对分析,结果显示:经测序获得的ptfA、ompA、ompH核酸序列同源性分别介于:97.2~100%;91.2~100%;84.6~100%。Tmp、omaP、olpB、plpE和Hgb等基因通过GenBank上已有序列进行比对分析其同源性,结果显示:上述基因核酸序列同源性分别介于98.6~100%;96.7~100%;98.1~100%;91.6~100%;98.3~100%。由此可见ptfA、ompA、Tmp、omaP、olpB、plpE和Hgb等7种基因同源性相对较高,达到90%以上。将上述7种较保守的保护性抗原基因克隆至pET-28a(+)载体中,后将重组质粒再导入到BL21(DE3)工程菌中进行表达,结果显示包涵体表达有6种分别为ptfA、ompA、plpE、Tmp、omaP和Hgb,可溶性表达1种,olpB。将上述蛋白经纯化、定量、配制为疫苗后3次免疫接种小鼠。统计免疫前后每组6只小鼠总增重情况发现,弱毒疫苗(增重12g);ompA免疫组和Hgb免疫组(增重33g);plpE免疫组(增重37g);Tmp免疫组、omaP免疫组及灭活疫苗免疫组(增重41g);olpB免疫组(增重45g)及非免疫组(增重44g)。由此可见与非免疫组相比弱毒疫苗对小鼠生长影响较大、基因工程亚单位苗和灭活疫苗次之。经滴鼻接种攻毒10~7CFU A型猪源多杀性巴氏杆菌,结果显示在10d内ompA疫苗组和plpE疫苗组有1只小鼠死亡,可见其免疫保护效果最好;omaP和灭活疫苗组有3只小鼠死亡,可见其具有一定的免疫保护效果;Tmp、olpB、Hgb、ptfA以及弱毒疫苗组和非免疫攻毒组有4只小鼠死亡,可见其免疫保护效果不明显。后重新选取ompA和plpE两个免疫保护效果好的重组蛋白疫苗重新免疫小鼠,再使用腹腔注射接种A型猪源多杀性巴氏杆菌60CFU进行攻毒实验,结果显示在攻毒后0~1.5d内非免疫攻毒组全部死亡,此时plpE和ompA免疫组保护率为100%和67%。在攻毒后第1.5~4d内,omp A免疫组保护率下降至33%,此时plpE免疫组保护率仍为100%。攻毒后第4~10d,ompA保护率维持在33%,而plpE免疫组保护率下降至50%。由此可见plpE的免疫保护效果强于ompA。综合上述实验结果,经滴鼻攻毒实验筛选发现plpE和ompA与目前商品化弱毒苗和其它蛋白疫苗相比有较好的安全性和免疫保护效果。继而选取上述两个保护性抗原通过腹腔注射接种攻毒后发现,plpE和ompA蛋白抗原保护效果确切,尽管不能完全保护小鼠抵抗P.multocida,但能减少发病率,延缓病情。同时也可发现plpE的免疫保护效果强于ompA,但从抗原在菌株中携带率方面分析,ompA基因相较plpE基因分布范围广且存在于A、D荚膜血清型中,因此ompA的免疫保护范围更广。