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本文分为以下两个部分进行探讨：
（一）CRISPR/Cas9/RecA基因编辑系统在N.gerenzanensis ATCC39727中的建立
N.gerenzanensis属于稀有放线菌，目前应用于链霉菌的基于同源重组的遗传操作体系并不适用于该菌种。在实验中，发现上述体系存在遗传操作步骤繁琐，费时耗力，甚至有时难于得到目标菌株的问题。因此，基于CRISPR/Cas9基因编辑系统，在N.gerenzanensis中建立新的高效遗传操作系统十分必要。区别于经典的CRISPR/Cas9基因编辑系统，为了降低Cas9蛋白作为核酸内切酶在宿主内持续表达产生的毒性问题，引入两个基因元件调控Cas9的表达，包括诱导型启动子tipAp和核糖体开关（riboswitch）。在未诱导时，由于Cas9蛋白表达受到抑制，其毒性相应降低。在接合转导成功并保证菌体正常生长一段时间后，诱导Cas9蛋白表达，成功实现了目的基因的高效敲除，敲除效率大约为68.75%。
为了进一步提高基因编辑的效率，本研究在上述诱导型CRISPR/Cas9编辑系统中引入了在同源修复过程中起关键作用的蛋白RecA。为此，在上述诱导型编辑系统的基础上进一步构建了包含RecA元件的CRISPR/Cas9/RecA基因编辑系统相关质粒，用于敲除dbv23。通过接合转导实验将质粒成功导入宿主菌株后，再诱导Cas9表达，使Cas9-sgRNA高效酶切DNA双链；在DNA的同源重组修复过程中，RecA蛋白促进DNA的同源修复，提高了基因编辑效率。最终CRISPR/Cas9/RecA基因编辑系统成功实现了dbv23基因的敲除，敲除效率接近100%。
（二）A40926高产菌株的构建
为了获得A40926高产菌株，将基于基因调控表达的理性筛选方法应用于本研究。首先通过启动子工程筛选能在N.gerenzanensis中高效表达的外源启动子，这些外源启动子包括ermE*p、KasO*p、sp44p、gadphp、rpsLp和psfp。分别将它们与报告基因egfp（增强型绿色荧光蛋白）组成完整表达盒，构建报告系统，导入放线菌中后，获得各个启动子相应的突变株。通过突变株的荧光强度对比分析，证实了gadph和rpsL两个启动子在N.gerenzanensis具有较强的转录活性，其中启动子gadph活性最强。
进一步筛选了dbv基因簇中包括dbv3和dbv4两个调控基因在内的10个dbv基因，分别置于高效启动子gadph调控下构建了过表达菌株，考察这些dbv基因对A40926合成的影响。结果表明，与野生型相比，Dbv3和Dbv4过表达菌株的A40926产量分别提高了约25%和18%。其他8个结构基因中，过表达编码甘露糖基转移酶的dbv20基因使A40926产量提高了约32%。另外，发现过表达编码脱乙酰酶的dbv21基因反而使A40926的产量显著下降这一现象产生的原因还有待与进一步研究。
综上，在稀有放线菌N.gerenzanensis中成功构建了优于传统遗传操作的CRISPR/Cas9/RecA基因编辑系统，该系统实现了100%的基因编辑效率。该系统的建立为研究N.gerenzanensis中基因水平的代谢调控及其菌株改造提供了有力的工具，同时也为链霉菌和其他放线菌的遗传操作提供了借鉴。另外，通过启动子工程，不但解析了dbv基因簇中主要基因对A40926合成的影响，而且获得了A40926产量显著提高的突变菌株，并进一步提高A40926产量奠定了基础。
（一）CRISPR/Cas9/RecA基因编辑系统在N.gerenzanensis ATCC39727中的建立
N.gerenzanensis属于稀有放线菌，目前应用于链霉菌的基于同源重组的遗传操作体系并不适用于该菌种。在实验中，发现上述体系存在遗传操作步骤繁琐，费时耗力，甚至有时难于得到目标菌株的问题。因此，基于CRISPR/Cas9基因编辑系统，在N.gerenzanensis中建立新的高效遗传操作系统十分必要。区别于经典的CRISPR/Cas9基因编辑系统，为了降低Cas9蛋白作为核酸内切酶在宿主内持续表达产生的毒性问题，引入两个基因元件调控Cas9的表达，包括诱导型启动子tipAp和核糖体开关（riboswitch）。在未诱导时，由于Cas9蛋白表达受到抑制，其毒性相应降低。在接合转导成功并保证菌体正常生长一段时间后，诱导Cas9蛋白表达，成功实现了目的基因的高效敲除，敲除效率大约为68.75%。
为了进一步提高基因编辑的效率，本研究在上述诱导型CRISPR/Cas9编辑系统中引入了在同源修复过程中起关键作用的蛋白RecA。为此，在上述诱导型编辑系统的基础上进一步构建了包含RecA元件的CRISPR/Cas9/RecA基因编辑系统相关质粒，用于敲除dbv23。通过接合转导实验将质粒成功导入宿主菌株后，再诱导Cas9表达，使Cas9-sgRNA高效酶切DNA双链；在DNA的同源重组修复过程中，RecA蛋白促进DNA的同源修复，提高了基因编辑效率。最终CRISPR/Cas9/RecA基因编辑系统成功实现了dbv23基因的敲除，敲除效率接近100%。
（二）A40926高产菌株的构建
为了获得A40926高产菌株，将基于基因调控表达的理性筛选方法应用于本研究。首先通过启动子工程筛选能在N.gerenzanensis中高效表达的外源启动子，这些外源启动子包括ermE*p、KasO*p、sp44p、gadphp、rpsLp和psfp。分别将它们与报告基因egfp（增强型绿色荧光蛋白）组成完整表达盒，构建报告系统，导入放线菌中后，获得各个启动子相应的突变株。通过突变株的荧光强度对比分析，证实了gadph和rpsL两个启动子在N.gerenzanensis具有较强的转录活性，其中启动子gadph活性最强。
进一步筛选了dbv基因簇中包括dbv3和dbv4两个调控基因在内的10个dbv基因，分别置于高效启动子gadph调控下构建了过表达菌株，考察这些dbv基因对A40926合成的影响。结果表明，与野生型相比，Dbv3和Dbv4过表达菌株的A40926产量分别提高了约25%和18%。其他8个结构基因中，过表达编码甘露糖基转移酶的dbv20基因使A40926产量提高了约32%。另外，发现过表达编码脱乙酰酶的dbv21基因反而使A40926的产量显著下降这一现象产生的原因还有待与进一步研究。
综上，在稀有放线菌N.gerenzanensis中成功构建了优于传统遗传操作的CRISPR/Cas9/RecA基因编辑系统，该系统实现了100%的基因编辑效率。该系统的建立为研究N.gerenzanensis中基因水平的代谢调控及其菌株改造提供了有力的工具，同时也为链霉菌和其他放线菌的遗传操作提供了借鉴。另外，通过启动子工程，不但解析了dbv基因簇中主要基因对A40926合成的影响，而且获得了A40926产量显著提高的突变菌株，并进一步提高A40926产量奠定了基础。