论文部分内容阅读
畜禽的产肉潜力与其肌纤维数量密切相关,而动物胚胎发育后期和动物出生后,肌纤维数量基本已固定。胚胎肌肉发生主要依赖于成肌细胞的增殖和分化,其增殖和分化的能力很大程度上能够决定动物出生后的肌纤维数量。为了探讨家禽骨骼肌发育的受调控情况,特别是由成肌细胞向肌管分化的过程,本研究以鸡为研究对象,以鸡原代成肌细胞为工具,利用RNA-seq技术对鸡原代成肌细胞分化过程中的mRNA、lncRNA和miRNA进行鉴定和分析,主要结果如下:研究一:分离培养鸡原代成肌细胞并诱导分化,利用RNA-seq技术分析成肌分化第0、1、3和5天的lncRNAs和mRNAs表达情况,结合生物信息学分析方法,鉴定在成肌分化过程中表达的lncRNAs,预测其可能的生物学功能。同时筛选成肌分化过程中的差异表达lncRNAs和mRNAs,进行K-means表达聚类分析。1、共鉴定出2,484条lncRNAs,其中包括2,285条基因间区长链非编码RNAs和199条反义长链非编码RNAs。这些lncRNAs在染色体上的分布具有明显的偏好性,1号染色体上分布最多（367）。与鸡已知的蛋白编码基因相比,lncRNAs具有更短的转录本、ORF长度以及更少的外显子数。2、选取lncRNA上下游10kb范围内的蛋白编码基因为其cis作用的靶基因,结果在1,530个lncRNAs附近共发现2,041个蛋白编码基因。功能富集分析显示,鸡原代成肌细胞分化过程中的lncRNAs在多条骨骼肌发育相关的通路中显著富集,如肌动蛋白细胞骨架调节、胰岛素信号通路、MAPK信号通路、FoxO信号通路以及黏着斑。3、以皮尔森相关系数为筛选依据（r>0.95或r<-0.95,p<0.05）,选择与lncRNAs显著相关的蛋白编码基因为其trans作用的靶基因,结果发现990个lncRNAs与7,436个蛋白编码基因显著相关,78,202对为正相关关系,27,724对为负相关关系。功能富集分析显示,鸡原代成肌细胞分化过程中的lncRNAs主要被富集在细胞周期、黏着斑、p53信号通路以及细胞外基质受体互作等生物学通路,参与成肌细胞增殖、分化和融合过程。4、在鸡原代成肌细胞分化过程中共筛选到906个差异表达lncRNAs和4,422差异表达mRNAs。功能富集分析显示,差异表达基因主要富集在骨骼肌分化、有丝分裂、细胞迁移和粘附等相关的生物学进程,同时发现多个成肌分化相关通路,如ECM受体互作、黏着斑、DNA复制、细胞粘附分子、细胞周期、肌动蛋白细胞骨架调控、PPAR信号通路等。5、对差异表达基因表达数据进行K-means聚类分析,最终将4,422个差异表达基因聚为4个类别（命名为K1、K2、K3和K4）。功能富集分析表明,K1可能在成肌细胞增殖或由增殖过渡到分化过程发挥重要作用;K4可能与成肌细胞分化启动或初始分化密切相关;K2和K3则可能与成肌细胞迁移、粘附以及融合有关。研究二:基于cis靶基因预测,联合差异表达基因数据,构建lncRNA-mRNA互作调控网络,筛选参与鸡骨骼肌发育调控的潜在候选因子;以鸡原代成肌细胞分化过程中的差异表达lncRNAs和差异表达mRNAs为数据源进行WGCNA分析,鉴定成肌分化过程中的功能模块,筛选调控鸡骨骼肌分化的重要候选因子。1、构建差异表达lncRNAs及其共表达cis作用靶基因间的互作网络。该网络中lncRNAs主要被富集在肌动蛋白细胞骨架调节、ErbB信号通路和胰岛素信号通路,参与骨骼肌分化、有丝分裂、细胞迁移和粘附等相关的生物学进程。SIX2、PAK3、HACD1、SULF1、SOCS1、MFW2、SIK1、CFL2、AC7C1、TNNI2等以及与它们关联的lncRNAs可被视为参与调控鸡骨骼肌发育的重要候选分子。2、WGCNA分析鉴定到6个与有丝分裂、肌细胞分化、肌动蛋白细胞骨架动态调节、能量代谢、细胞迁移和粘附等GO分类密切相关的基因模块。模块中高连通性枢纽基因可能对骨骼肌发育具有潜在的重要作用,包括TRIM55、DES、FAM65B、ACTC1、TNNI2、FEN1、AIF1L、ALDBGALT0000002581、NEK6、FAR-1 等。研究三:利用RNA-seq技术获得成肌分化过程中miRNA的表达谱。结合生物信息学分析方法,鉴定在成肌分化过程中表达的miRNAs,预测其可能的生物学功能。同时,整合差异表达miRNAs和mRNAs表达数据,辅以多种功能性分析和互作网络构建软件进行miRNA-mRNA联合分析,筛选参与鸡骨骼肌发育调控的潜在候选因子。1、共鉴定出712个miRNAs成熟体,对应584个miRNA前体,属于123个miRNAs家族,此外还鉴定到224个新miRNAs。2、鸡原代成肌细胞中miRNA的表达量普遍较低,其中TPM在1-10的miRNAs数目占总miRNAs数量的85.32%以上,大于10,000的miRNAs仅占1.4%左右。3、每个文库表达丰度前15共19个miRNAs的靶标通路分析表明,介导靶向抑制参与鸡原代成肌细胞分化调控的功能性miRNAome可能很小且趋于高表达。4、对成肌细胞不同分化阶段的miRNA表达进行差异表达分析,共鉴定出298个DEMs。相邻阶段DEMs功能富集分析显示,DEMs在骨骼肌发育、有丝分裂、细胞迁移和粘附相关的通路显著富集。5、构建差异表达miRNAs及其差异表达靶基因间的互作调控网络,筛选到多个参与鸡骨骼肌发育调控的潜在候选因子,如miR-206、miR-133b、miR-204、miR-214、miR-7、miR-7b、miR-146b-5p、miR-222b-5p、miR-10a-5p、miR-203a、miR-10b-5p、miR-34a-5p、miR-218-5p、CDK6、AOX1、FSTL1、SESN1、TIMP2 等。