活血止痛膏应用历史悠久、疗效确切,但现有剂型橡胶贴膏存在皮肤刺激性、释放度低等弊端,限制其临床应用;新型高分子材料的应用可促进药物经皮渗透,减少皮肤刺激性,具有广阔的研究与开发前景。因此,本课题组前期将活血止痛方制备成凝胶贴膏及微乳凝胶剂。但新剂型能否提高活血止痛方中药物穿过角质层屏障的速率,能否增加皮下药物浓度是将其作为新型载药体系的前提,因此需对三种外用膏剂进行经皮渗透性及局部药动学研究。目前,外用给药制剂经皮渗透性研究最常用的方法是Franz扩散池法,该方法操作简单,实验条件易于控制;而局部药动学研究最常用的手段是微透析技术,该方法具有在体、实时和在线长时间取样等优点。因此,本研究以活血止痛膏中Pae、Eug及Pip为指标性成分,利用Franz扩散池法及微透析技术对活血止痛橡胶贴膏、凝胶贴膏和微乳凝胶剂的经皮渗透性及体内药动学进行比较研究,为其安全、高效新型载药系统的研究提供实验依据。1.活血止痛膏经皮渗透性研究(1)透皮接收液中药物含量测定方法的建立本文利用HPLC建立透皮接收液中Pae、Eug及Pip的含量测定方法,并进行方法学考察,结果表明该色谱方法的专属性、线性、精密度及样品的稳定性均符合要求。(2)透皮接收液的筛选本文以Qn、Jss及对皮肤结构影响的大小为指标,对不同的透皮接收液进行筛选;结果表明以PEG 400-Et-NS(3:3:4)为透皮接收液,Pae、Eug及Pip的Qn和Jss较高,对皮肤结构的影响较小,因此选择PEG 400-Et-NS(3:3:4)作为活血止痛三种外用膏剂经皮渗透性研究的透皮接收液。(3)活血止痛三种外用膏剂经皮渗透性比较研究本文利用Franz扩散池法,通过比较Qn、Jss对活血止痛橡胶贴膏、凝胶贴膏和微乳凝胶剂的经皮渗透性进行比较研究。结果表明橡胶贴膏中Pae、Eug及Pip的Q24分别为(2.40±0.20)、(19.9±2.46)及(0.77±0.24)μg·cm-2,Jss分别为 0.18、1.26 及 0.02 μg·cm-2·h-1;凝胶贴膏中 Pae、Eug 及 Pip 的 分别为(8.77±0.42)、(96.0±5.5)及(5.53±0.13)μg·cm-2,Jss分别为0.63、6.12及0.23 μg·cm-2·h-1;微乳凝胶剂中Pae、Eug的Q24分别为(2.59±0.09)及(28.5±2.3)μg·cm-2,Jss分别为 0.21 及 1.94μg·cm-2·h-1。由结果可知,丹皮酚的Q24:凝胶贴膏>微乳凝胶剂≈橡胶贴膏,Jss凝胶贴膏>微乳凝胶剂≈橡胶贴膏;丁香酚的Q24:凝胶贴膏>微乳凝胶剂>橡胶贴膏,Jss凝胶贴膏>微乳凝胶剂>橡胶贴膏;胡椒碱的Q24:凝胶贴膏>橡胶贴膏,Jss凝胶贴膏>橡胶贴膏。提示凝胶贴膏作为载药体系,能明显提高Pae、Eug及Pip的Qn和Jss,而微乳凝胶剂中药物的经皮渗透性没有明显变化。为研究三种外用膏剂中药物的经皮渗透机制,分别采用Zero order model、First order model、Higuchi model、Hixson-Crowell model 及 Korsmeyer-Pappas model 对活血止痛膏经皮渗透曲线进行回归分析,结果表明:①三种外用膏剂中Pae、Eug及Pip的Zero order model拟合方程的相关系数r均较First order model的r大,提示活血止痛膏中药物经皮渗透过程均与其在膏中的含量无关;②橡胶贴膏中Pae、Eug及Pip的Higuchi model拟合方程的r分别为0.9632、0.9909及0.8963,Hixson-Crowell model拟合方程的r分别为 0.7578、0.8115 及 0.4715,Korsmeyer-Pappas model 拟合方程的 r 分别为 0.9745、0.9860及0.8431,提示橡胶贴膏中三个成分的经皮渗透机制属于扩散过程;③凝胶贴膏中Pae、Eug 及 Pip 的 Higuchi model 拟合方程的 r 分别为 0.9779、0.9892 及 0.9643,Hixson-Crowell model 拟合方程的 r 分别为 0.7830、0.8140 及 0.9400,Korsmeyer-Pappas model 拟合方程的r分别为0.9802、0.9850及0.9967且斜率k分别为0.6616、0.7889及1.1506,提示凝胶贴膏中Pae、Eug的经皮渗透机制属于扩散与溶蚀的共同作用,而Pip经皮渗透机制属于溶蚀作用;④微乳凝胶剂中Pae、Eug的Higuchi model拟合方程的r分别为0.9619、0.9823,Hixson-Crowell 拟合方程的 r 分别为 0.7398、0.7783,Korsmeyer-Pappas model拟合方程的r分别为0.9620、0.9713且斜率k分别为0.759、0.865,均介于0.45～0.89之间,但更接近于0.89,提示微乳凝胶剂中两成分的经皮渗透机制属于扩散和溶蚀的共同作用,但以溶蚀作用为主。2.经皮微透析方法的建立(1)探针吸附性考察由于活血止痛膏有效成分脂溶性强,存在探针吸附的问题,因此本部分以探针吸附性为指标,对活血止痛膏中Pae、Eug及Pip的灌流液进行筛选。结果表明以Et-NS(3:7)作为灌流液,探针对三种成分均无明显的吸附。(2)探针回收率影响因素的考察本文考察探针体内外回收率的稳定性和重复性,及浓度、校正方法对Pae、Eug及Pip三种成分微透析探针回收率的影响。结果表明在8h内,三种成分体内外回收率均能保持稳定;交替用含药溶液和空白灌流液灌流探针3次,三种成分体内外回收率基本不变。不同浓度 Pae(2.45～53.64 mg·mL-1)、Eug(4.26～32.15 mg·mL-1)及 Pip(5.75～45.87 mg·mL-1)体内外回收率分别为(45.07±4.66)%、(41.3±3.96)%及(27.82±2.95)%,即三种成分的探针回收率对浓度没有依赖性:在相同条件下,零净通量法、透析法及反透析法在相同条件下所测得的探针体外回收率几乎相等。提示采集部位药物的浓度可用体外测得的回收率或在体回收率进行校正,同时也证明了本研究建立的微透析方法可用于活血止痛膏的经皮药动学研究。3.活血止痛膏经皮药动学研究(1)UPLC-MS测定透析液中药物含量方法的建立本文利用UPLC-MS建立经皮透析液中Pae、Eug及Pip的含量测定方法,并进行方法学考察,结果表明该分析方法的专属性、线性、精密度及基质效应等均符合要求。(2)活血止痛膏三种外用膏剂体内药动学比较研究以Cmax、Tmax、AUC、t1/2及MRT为指标,利用微透析技术对活血止痛橡胶贴膏、凝胶贴膏及微乳凝胶剂进行经皮药动学比较研究。结果表明:①橡胶贴膏中Pae、Eug及 Pip 的(Cmax分别为(12.59±3.29)、(18.87±7.11)及(1.80±1.22)ng·mL-1,Tmax分别为(186.7±48.4)、(240.0±138.6)及(488.0±150.7)min,dUC 0-760分别为(4.85±1.83)、(6.92±3.57)及(0.80±0.46)μg·mL-1·min-1,t1/2分别为(201.1±95.3)、(218.2±123.3)及(369.6±143.3)min,MRT分别为(434.7±97.8)、(444.2±167.9)及(842.6±142.0)min;②凝胶贴膏中 Pae、Eug 及 Pip 的 分别为(83.46±27.09)、(1269.4±884.7)及(0.50±0.20)ng·mL-1,Tmax分别为(166.7±39.3)、(120.0±0.0)及(184.0±45.6)min,AUC 0-760分别为(34.79±11.15)、(375.7±208.4)及(0.20±0.12)t1/2分别为(372.9±87.1)、(356.2±182.6)及(391.4±150.2)min,MRT分别为(625.3±136.9)、(580.9±232.3)及(658.4±230.2)min;③微乳凝胶剂中 Pae、Eug的Cmax分别为(33.88±11.40)、(166.4±60.3)ng·mL-1,Tnax分别为(133.3±20.7)、(88.0±17.9)min,AUC 0-760分别为(11.09±4.46)、(35.29±17.98)μg·mL-1·min-1,t1/2分别为(275.2±91.6)、(227.3±177.1)min,MRT分别为(461.9±127.0)、(379.8±254.8)min。由结果可知:①对于Pae:凝胶贴膏的Cmax是微乳凝胶剂的2.5倍、橡胶贴膏的6.6倍,AUC 0-760是微乳凝胶剂的3.1倍、橡胶贴膏的7.2倍,t1/2是微乳凝胶剂的1.4倍、橡胶贴膏的1.9倍,MRT是微乳凝胶剂、橡胶贴膏的1.4倍;橡胶贴膏的Tmax是凝胶贴膏的1.1倍、微乳凝胶剂的1.4倍;②对于Eug,凝胶贴膏的Cmax是微乳凝胶剂的7.6倍、橡胶贴膏的67.3倍,AUC 0-760是微乳凝胶剂的10.6倍、橡胶贴膏的54.3倍,t1/2是微乳凝胶剂、橡胶贴膏1.6倍,MRT是橡胶贴膏的1.3倍、微乳凝胶剂的1.5倍;橡胶贴膏的Tmax是凝胶贴膏的2.0倍、微乳凝胶剂的2.7倍;③对于Pip,橡胶贴膏的Cmax是凝胶贴膏的3.6倍,Tmax是凝胶贴膏的2.7倍,AUC 0-760是凝胶贴膏的4.1倍,MRT是凝胶贴膏的1.1倍;凝胶贴膏的t1/2是橡胶贴膏的1.4倍。提示橡胶贴膏载药体系对Pip及Eug有一定的缓释作用;凝胶贴膏作为载体对Pae及Eug穿过皮肤有明显的促进作用,还能增加Pae的皮肤滞留时间;然而对于Pip,传统的橡胶贴膏在提高其经皮渗透量、渗透速率方面具有明显的优势。