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谷氨酸脱羧酶（Glutamate decarboxylase, GAD）能催化L-谷氨酸脱羧生成γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric, GABA），反应过程消耗一个质子。来源于乳酸菌的GAD的最适pH为4.0-5.0，在偏中性条件下，酶活大幅下降，这不利于GABA的合成。为了拓展其有效的pH范围，本论文对短乳杆菌Lb85的谷氨酸脱羧酶GadB1进行了分子改造研究，并利用突变酶GadB1M在谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）中“一步法”生物合成GABA。主要研究内容和结果如下。1.克隆短乳杆菌Lb85谷氨酸脱羧酶基因gadB1，在大肠杆菌BL21(DE3)中进行过量表达、纯化和酶活测定。经过SDS-PAGE电泳和凝胶色谱分析，证明该酶分子量约为54kDa，以单聚体形式存在。最适pH为4.6，pH高于4.6酶活急剧下降，最适温度为40-50℃；在pH5.0-5.5之间以及40-60℃稳定性较好；在0-100μmol·L-1范围内，辅酶PLP能提高酶活力；Ba2+、Ca2+、K+、Na+对酶活力有激活作用；其km和Vmax值分别为22.90mmol·L-1和38.46U·mg-1。2.基于对GadB1单体的同源建模，设计多个突变位点，通过定点突变获得一系列突变酶，其中性能最好的突变体为M1（GadB1E312S），其在pH6.0下，比酶活较野生型GadB1提高53.90%，催化效率（kcat/km）是野生型的2.30倍。3.对GadB1进行定向进化，基于其反应原理建立了一种灵敏高通量的平板指示剂筛选法，通过一轮易错PCR，从大约800个突变体中，筛选获得了一株优良的突变体M2（GadB1T17I/D294G/Q346H）。其在pH6.0下，比酶活是野生型的3.94倍；在pH4.6和pH6.0，kcat/km分别是野生型的11.32倍和25.26倍。在突变体M2中， T17I和D294G突变能够拓展酶的有效pH值范围，Q346H突变能提高酶在酸性pH条件下对底物的亲和力。4.对突变体M2进行E312S定点突变，得到了突变体M3（GadB1T17I/D294G/E312S/Q346H）。在pH4.6和pH6.0， kcat/km分别是野生型的13.1倍和43.16倍。说明定点突变位点E312S和易错PCR突变位点具有协同增效作用。在pH6.0下，对野生GadB1和突变体GadB1M3催化能力进行了比较， GadB1M3催化合成GABA的能力是野生型GadB1的6.32倍。5.构建了C. glutamicum ATCC13032/pEC-gadB1、C. glutamicum ATCC13032/pEC-gadB1M1、C. glutamicum ATCC13032/pEC-gadB1M2和C. glutamicum ATCC13032/pEC-gadB1M3四株工程菌，摇瓶发酵表明，表达突变体酶的重组菌的GABA产量比表达野生酶的重组菌分别提高了9.60%、20.30%和63.90%。对重组菌株C. glutamicum ATCC13032/pEC-gadB1和C. glutamicum ATCC13032/pEC-gadB1M3进行3L罐发酵，发酵72h，两者的GABA产量分别为10.37和16.70g·L-1，表达突变体M3的重组菌的GABA产量相对表达野生酶的重组菌提高61%。结果表明，这些突变位点的替换能够扩宽酶的有效pH范围和提高其GABA的合成能力。