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关节软骨缺损是骨关节临床最常见疾病之一,由于软骨组织内没有血管供应、神经支配和淋巴回流,组织内的软骨细胞的迁移及增殖能力较低,导致软骨自我修复能力很差,各种损伤、炎症和退行性病变均可引起不可逆性软骨损伤。目前临床上多采用以药物缓解疼痛为主的保守治疗,无法实现软骨的再生修复。研究人员在积极尝试通过用外科手术的方式来探寻更好的治疗方式,虽然目前采取的微骨折、自体软骨/软骨细胞移植等技术有一定的效果,但是仍难以实现完美的软骨组织及功能的再生修复。目前,基于干细胞来源广泛,免疫原性低,具备多向分化功能等优势开展的干细胞组织工程已成为软骨再生修复的一种新治疗策略。干细胞在组织修复中所发挥的作用及其机制迅速成为研究热点。随着对干细胞旁分泌因子在组织修复中发挥重要作用的认识,利用间充质干细胞(MesenchymalStemCells,MSCs)旁分泌体进行无细胞治疗来替代传统细胞疗法受到越来越多研究者的关注。为了探究MSCs的旁分泌体在治疗骨性关节炎所致软骨缺损中发挥的作用及机制,本文首先比较了体外培养MSCs所获条件培养基(Conditionedmedium,CM)中所含MSCs旁分泌体不同组成成分:可溶性蛋白(SolubleProteins,SPs)、外泌体(Exosomes,Exos)和微泡(Micro-vehicles,MVs)对保护炎症刺激下软骨细胞表型及促进软骨修复的作用差异。接着研究了脂肪间充质干细胞(AdiposeTissue-derivedStemCells,ADSCs)及骨髓间充质干细胞(BoneMarrowDerivedStemCells,BMSCs)在2D/3D培养条件下所得CM维持软骨细胞表型能力的差异,通过蛋白质组学技术及生物信息学分析找到了ADSCs来源SPs中发挥软骨保护作用的可能蛋白为网钙结合蛋白-2(Reticulocalbin-2,RCN2)。最后通过构建RCN2低表达和过表达细胞系初步阐明了RCN2在调控软骨细胞表型中发挥作用的可能机制。主要研究结果如下:1.体外培养大鼠软骨细胞在促炎因子IL-1β存在的情况下,培养基中添加大鼠BMSCs来源的CM成分SPs能更好的恢复软骨细胞表型,而添加CM中另两种主要成分Exos和MVs效果不明显。提示BMSCs的旁分泌体中,可能发挥保护软骨细胞免受炎症环境影响维持其正常形态及表型作用的,不是Exos和MVs而是SPs。在大鼠OA模型中关节腔注射Exos、MVs和SPs,通过对样本的组织学评价也证实了SPs能够促进大鼠软骨基质形成。2.将ADSCs和BMSCs培养于不同2D/3D条件以制备CM,经PCR和Westernblot实验检测发现ADSCs来源的CM更有利于维持软骨表型;ADSCs组间比较发现,3D培养所得的CM维持软骨表型效果优于2D培养所得CM,而3D支架孔径的改变对所得CM维持软骨表型能力的影响不大;通过蛋白组学对各CM中SPs进行差异蛋白比对分析,发现ADSCs各组SPs间3D培养组与2D培养组对比所得差异蛋白数量多于不同孔径3D支架之间对比,说明3D支架孔径的改变对CM中SPs表达差异影响不大;通过蛋白组学对及生物信息学分析,我们从ADSCs来源的SPs中优选了四个最可能影响软骨细胞表型的分子:CAPNS1、LAL、MAT2A和RCN2,对上述四个分子进行shRNA转染实验检测其对软骨细胞软骨表型的影响,结果显示RCN2基因下调后,MMP-13的表达明显降低,SOX-9的表达增加,但对Col-X和Col-I表达影响较少,提示RCN2相对其他蛋白对软骨细胞软骨表型的影响更大,可能是SPs中的主要功能蛋白。3.通过构建稳定的人/大鼠的软骨细胞低表达和过表达RCN2细胞系,研究RCN2调控软骨细胞软骨表型的机制。结果显示:敲低RCN2后软骨基质降解酶MMP-13和ADAMTS-5的表达量降低,软骨基质标志蛋白Col-II、SOX-9、ACAN升高,过表达RCN2后软骨基质降解酶MMP-13和ADAMTS-5的表达量升高,软骨基质标志蛋白Col-II、SOX-9、ACAN降低,进一步实验发现敲低RCN2后NFAT1、NFAT2的表达水平升高,过表达后相反。提示:RCN2可能通过NFAT信号通路调控软骨基质的形成。综上所述,本文明确了骨髓间充质干细胞分泌体中的SPs相比Exos和MVs能更好的恢复促炎因子IL-1β存在下的软骨细胞形态及软骨表型。脂肪间充质干细胞来源的CM在维持软骨细胞软骨表型方面优于骨髓间充质干细胞,3D支架培养所得CM优于2D培养,3D支架孔径的改变对CM功能影响不大。通过蛋白质组学数据筛选出ADSCs来源SPs中RCN2可能对软骨基质有影响,进一步实验证实RCN2可能是通过NFAT信号通路调控软骨细胞表型。