背景与目的2014年美国癌症预测数据显示,结直肠癌新增病例和死亡人数分别为136830和50310,各占癌症新发和死亡病例的8%,是男性和女性第三常见的癌症。溃疡性结肠炎、家族性腺瘤性息肉病、遗传性非息肉病性大肠癌综合征是结直肠癌发生的三大高危因素,研究发现约有20%的癌症发生原因与长期反复的慢性炎症刺激有关,溃疡相关性结直肠癌是导致溃疡性结肠炎病人死亡的主要原因之一。目前结直肠癌治疗以手术为首选,配合放、化疗治疗,然而放、化疗治疗存在严重的毒副作用。近年研究发现,祖国传统医学在防治消化道肿瘤方面有非常好的疗效,主要表现在改善肿瘤患者的生活质量,延长其存活期等方面。因此在祖国传统医学领域寻找可有效减轻放、化疗毒副反应,改善患者生活质量,且具有防治肿瘤作用的中药复方,并阐明其防治肿瘤的机制具有十分重要的临床指导意义。芍药汤具有清热燥湿,调气和血的功效,为治疗湿热痢疾的经典方。临床常用于治疗炎症性肠病、细菌性痢疾、放化疗后导致的腹泻等。有文献报道芍药汤具有抗炎、抗菌的药理作用,其主要有效成分丹皮酚(Paeonol)能抑制结肠癌细胞的增殖。目前,对于芍药汤是否能防治结肠炎相关性结肠癌及其作用机制仍不清楚,研究芍药汤防治结肠炎相关性结肠癌的机制,对发挥中医药防治结肠炎相关性结肠癌有重要的意义。上皮细胞间质化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指在某些因素作用下,上皮细胞失去细胞极性,使细胞间黏附连接和紧密连接丢失,并获得了浸润和迁移的能力,变成了具有间质细胞形态和特性的细胞的现象。EMT被公认在炎症性肠病的发病机理中起重要作用,其与肿瘤发生发展的关系也越来越受到人们的关注。目前对于EMT的调控机制尚不十分清楚,研究认为其主要受一些转录因子的调控。Snail作为具有锌指样结构的转录因子,不仅可启动EMT,并能调控EMT。NF-κB为一种炎症相关肿瘤的启动因子,与肿瘤的发生发展有密切关系。NF-κB可被炎症因子激活,同时又可诱导炎症因子的释放。TNF-α、IL-1β和IL-6是受NF-κβ调节的多功能细胞因子,其不仅参与炎症的发生发展,在EMT的启动过程中也发挥至关重要的作用。目前尚未发现有文献报道芍药汤防治结肠炎相关性结肠癌,本研究对芍药汤临床治疗结肠炎相关性结肠癌提供实验依据的同时,进一步阐释了EMT及炎症因子在芍药汤防治结肠炎相关性结肠癌中所起的作用。方法1.采用高效液相色谱法对芍药汤的制备进行质控按处方分别称取各味中药,采用传统水煎方法,分别加水为药量的10、6倍,煎煮两次,过滤并合并两次煎煮药液,通过旋转蒸发仪浓缩成膏状物,干燥后称取重量并记录。然后,加入适量甲醇溶液,于超声下溶解,0.45μmm微孔过滤器过滤后备用。分别称取黄连素及黄芩素对照品适量,加甲醇溶液制成1mg/mL的溶液,0.45μm微孔过滤器过滤后备用。按以下色谱条件进行检测：色谱柱：Shimadzu C18 VP ODS (250×4.6 mm,5μm);流动相：乙腈-0.5%o醋酸水溶液；流速：1.0mL/min;柱温：25℃；检测波长：254nm。通过Shimadzu高效液相色谱仪分析不同批次芍药汤的稳定性及检测芍药汤中主要有效成分,记录色谱图,并分析。2. Azoxymethane (AOM)/dextran sodium sulfate (DSS)诱导小鼠结肠炎相关性结肠癌选用65只SPF级雄性C57BL/6J小鼠,随机分为三组,空白对照组(Control)15只,模型组(Model)30只,芍药汤组(Shaoyao decoction, SYD)20只,实验前记录小鼠体重及编号。根据文献方法建立结肠炎相关性结肠癌动物模型,给予单次小剂量腹腔注射AOM,联合3个循环DSS喂养。芍药汤组在给予与模型组相同干预的基础上,同时给予芍药汤(7.12g/kg/d)灌胃。实验期间监测小鼠体重及进食量变化,观察小鼠一般状态如毛发、活动、便血、脱肛等一般情况,并记录小鼠死亡情况。于第15周结束实验,称量小鼠体重并记录,采用眼球采血法获取血液,分离血清；分离小鼠脾脏,测量其重量；分离结肠组织,观察小鼠结肠肿瘤发生的部位、大小、数量及称取肿瘤重量,测量结肠长度及称量其重量。分离的组织分装保存,用于后续实验研究。3.苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining, HE)染色观察小鼠结肠的组织学变化小鼠结肠组织制成石蜡切片,通过HE染色,于显微镜下观察小鼠结肠组织的组织学特征,拍照,并分析结肠肿瘤组织的分化水平及侵袭程度。4.免疫组织化学法(Immunohistochemistry, IHC)观察致癌相关蛋白、EMT相关蛋白及NF-κB、F4/80的表达小鼠结肠组织制成石蜡切片,IHC采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(streptavidin-perosidase, SP)。于显微镜下观察致癌相关蛋白PCNA、p53、 COX-2、β-catenin, EMT相关蛋白E-cadherin、Vimentin、Fibronectin、N-cadherin以及NF-κB、F4/80的分布部位及表达强弱,分析芍药汤对以上相关蛋白表达的影响。5.免疫印迹(Western blot, WB)法分析芍药汤对致癌相关蛋白、EMT相关蛋白表达的影响提取组织的总蛋白后用WB法检测致癌相关蛋白PCNA、p53、COX-2、 β-catenin, EMT相关蛋白E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、Snail、Claudin-1的表达情况,分析芍药汤对其表达的影响。6. Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT)法检测芍药汤对结肠癌细胞活力的影响选用SW480、HCT116两种结肠癌细胞,37℃ 5%CO2孵箱培养。收集对数生长期细胞,按104/孔细胞密度铺入96孔板。待细胞贴壁后,分别加入浓度梯度的芍药汤(2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL),每孔100μ1。每个浓度设6个复孔,同时设立空白对照组,给药后分别培养12h、24h后,每孔中加入5mg/mL MTT 20μl,继续培养4h。弃旧液,每孔加入150μ1二甲基亚砜,置摇床上振荡10min,至紫色结晶完全溶解。于酶标仪波长为490nm处测量其吸光值并记录结果。细胞存活率=试验组吸光值/对照组吸光值。实验重复3次后,统计分析。7.MTT法检测丹皮酚对结肠癌细胞活力的影响选用SW480、HCT116两种结肠癌细胞,37℃5%CO2孵箱培养。收集对数生长期细胞,按104/孔细胞密度铺入96孔板。待细胞贴壁后,分别加入浓度梯度的丹皮酚(0.2mM/L、0.4mM/L、0.6mM/L、0.8mM/L),每孔100g1。每个浓度设6个复孔,同时设立空白对照组,给药后分别培养24h、48h后,每孔中加入5mg/mL MTT 20μl,继续培养4h。弃旧液,每孔加入150μ1二甲基亚砜,置摇床上振荡10mmin,至紫色结晶完全溶解。于酶标仪波长为490nm处测量吸光值并记录结果。细胞存活率=试验组吸光值/对照组吸光值。实验重复3次后,统计分析。8.WB法分析芍药汤及丹皮酚对结肠癌细胞致癌相关蛋白表达的影响SW480、HCT1 16两种结肠癌细胞以1×105/孔密度接种于6孔板中,待细胞贴壁后,分别加入2mg/mL、4mg/mL芍药汤,0.2mM/L、0.4mM/L丹皮酚处理,每孔2ml。设立空白对照组,给药后芍药汤干预24h,丹皮酚干预48h后,终止培养,提取细胞总蛋白,经蛋白定量后,每组取约50μg蛋白样品,加入5×上样缓冲液后进行10% SDS-PAGE,用湿转法将蛋白转印至PVDF膜。5%脱脂牛奶室温封闭1h,一抗4℃孵育过夜,HRP偶联的相应二抗(1：2000稀释)室温孵育lh。然后用化学发光法曝光成像。9.WB法分析芍药汤及丹皮酚对Snail诱导的EMT的影响选用结肠癌细胞SW480,收集对数生长期细胞,以1×l05/孔密度接种于6孔板中。待细胞贴壁后,用质粒转染试剂盒,按试剂盒说明操作,将Snail质粒转染入SW480细胞,转染后分别加入浓度梯度的芍药汤(2mg/mL、4mg/mL)干预24h,丹皮酚(0.2mM/L、0.4mM/L)干预48h,每孔2ml。同时设立空白对照组,干预至相应的时间后提取细胞总蛋白,用Western blot方法检测EMT相关蛋白的表达,分析芍药汤及丹皮酚对其表达的影响。10. Luminex法检测血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量采用小鼠多因子检测试剂盒通过Luminex系统检测血清中IL-1β、IL-6TNF-a的含量,分析芍药汤对上述炎症因子水平的影响。11.统计方法所有数据采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析,实验数据采用均数±标准差(x±SD)表示。对于定量数据,两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,方差齐采用LSD法,方差不齐采用DunnettT3法。等级资料采用非参数检验；生存分析采用Kaplan-Meier法分析,P<0.05具有统计学意义。结果1.芍药汤的制备质量较稳定经高效液相色谱法分析6批芍药汤样品,发现6批样品的色谱图中相应的色谱峰的位置基本一致,其重复性相似值为0.937-0.977。芍药汤样品中含有黄连素及黄芩素。2.芍药汤有效改善小鼠的一般状况,并降低小鼠死亡率给予AOM/DSS干预后,模型组小鼠出现明显倦怠少动,毛发暗淡,精神萎靡,部分严重者出现稀便、血便等现象,小鼠体重明显减轻。给予芍药汤后小鼠的一般情况可有效改善,体重减轻程度比模型组轻(P<0.01)空白对照组小鼠全部存活,模型组小鼠存活率仅有23.30%,而芍药汤组小鼠存活率为60.00%。与模型组相比,芍药汤能明显延长小鼠存活时间,显著提局AOM/DSS干预小鼠的存活率,P值为0.032,差异具有统计学意义。3.芍药汤减少AOM/DSS诱导的结肠炎相关性结肠癌肿瘤的数目及大小模型组及芍药汤组小鼠肿瘤的发生率为100%,肿瘤发生的部位主要在中、远段结肠。与模型组相比,芍药汤组小鼠肿瘤发生的数量降低了42.80%,差异有统计学意义(P<0.01)。芍药汤显著延缓肿瘤的发展,使直径>3mm的肿瘤数量降低59.20%(P<0.01),并显著降低肿瘤的重量及体积。与空白对照组相比,模型组小鼠的结肠长度显著缩短,重量显著增加(P<0.01)。芍药汤能显著改善小鼠结肠缩短(P<0.05),减轻结肠重量(P<0.01)4.芍药汤降低肿瘤的分化水平及改善其侵袭程度HE染色结果显示AOM/DSS诱导的结肠炎相关性结肠癌在组织学上主要表现为管状腺瘤或腺癌。在模型组,AOM/DSS诱导产生的肿瘤大多数为高分化伴侵袭的肿瘤,芍药汤明显改善肿瘤的侵袭程度,P=0.041。5.芍药汤降低致癌相关蛋白的表达IHC结果显示,模型组中致癌相关蛋白PCNA、COX-2在肿瘤组织中表达增高,p53主要在肿瘤组织上皮及非肿瘤隐窝部位高表达,表明在AOM/DSS诱导的结肠炎相关性结肠癌中p53发生突变,肿瘤组织中出现β-catenin核转移。与空白对照组相比,四种致癌相关蛋白在模型组中表达明显增强,P<0.01,差异有统计学意义。给予芍药汤干预能显著降低四种致癌相关蛋白的表达(P<0.05)。WB结果显示,与空白对照组相比,四种致癌相关蛋白在模型组中高表达,有显著性差异。与IHC结果一致,芍药汤组四种致癌相关蛋白表达明显降低(P<0.05),与模型组相比,差异有统计学意义。6.芍药汤及丹皮酚抑制结肠癌细胞的增殖以2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL的芍药汤作用于SW480、HCT116两种结肠癌细胞12h、24h后,细胞存活率显著降低,不同浓度加药组组间存活率有显著性差异(P<0.01)。与空白对照组相比,在两种细胞株中,给药组细胞存活率均显著降低(12h：P<0.01；24h：P<0.05)。以02mM/L、0.4mM/L、0.6mM/L、0.8mM/L的丹皮酚作用于SW480、HCT116细胞24h、48h后,细胞存活率显著降低,不同浓度加药组组间存活率有显著性差异(P<0.01)。与空白对照组相比,在两种细胞株中,给药组细胞存活率均显著降低(P<0.01)。两种细胞在给予浓度梯度的芍药汤及丹皮酚干预后,细胞存活率呈明显的浓度梯度降低；随着时间延长,存活率也随之降低。芍药汤及丹皮酚对结肠癌细胞的抑制作用具有时间和剂量依赖性。7.芍药汤及丹皮酚降低结肠癌细胞致癌相关蛋白的表达WB结果显示,结肠癌细胞中致癌相关蛋白PCNA、p53、COX-2、β-catenin表达增高,给予不同浓度芍药汤(2mg/mL、4mg/mL)干预24h,丹皮酚(0.2mM/L、 0.4mM/L)干预48h后,与空白对照组相比,PCNA、p53、COX-2、β-catenin蛋白表达显著降低(P<0.05)。8.芍药汤改善AOM/DSS及Snail诱导的EMT,丹皮酚抑制Snail诱导的EMTIHC结果显示,AOM/DSS诱导的结肠癌小鼠EMT的标志性蛋白E-cadherin表达缺失,N-cadherin、Fibronectin、Vimentin表达明显增强,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组相比,芍药汤显著增高肿瘤组织中E-cadherin的表达,降低N-cadherin、Fibronectin、Vimentin的表达(P<0.05)。WB结果与IHC结果一致,E-cadherin在模型组中表达缺失,而N-cadherin、 Vimentin、Snail、Claudin-1表达明显增强,与空白对照组相比,有显著性差异(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin:P<0.05; Snai1、Claudin-1:P<0.01)。芍药汤显著上调E-cadherin的表达,下调N-cadherin、Vimentin、Snai1、Claudin-1的表达,与模型组相比,P<0.05。Snail过表达的结肠癌细胞SW480中,N-cadherin、Vimentin的表达上调,而E-cadherin的表达降低。芍药汤及丹皮酚均能显著降低Snail诱导的高表达N-cadherin、Vimentin,上调低表达的E-cadherin (P<0.01)。9.芍药汤降低巨噬细胞表面标志物F4/80及NF-κB的表达IHC结果显示,与空白对照组比较,模型组中巨噬细胞表面标志物F4/80及炎症相关的调节因子NF-κB表达明显增强(P<0.01)。芍药汤能显著降低两者在肿瘤组织中的表达,与模型组相比,有显著性差异(P<0.05)。10.芍药汤降低血清中炎症因子的含量小鼠血清中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的水平在模型组中显著升高,而给予芍药汤干预后,IL-1β、IL-6、TNF-α在血清中的含量明显降低,与模型组相比,差异有统计学意义(IL-1β:P<0.01; IL-6、TNF-α:P<0.05)结论1.芍药汤的制备过程合理。2.芍药汤抑制AOM/DSS诱导的结肠炎相关性结肠癌。3.芍药汤通过改善AOM/DSS诱导的结肠炎相关性结肠癌的EMT防治结肠炎相关性结肠癌。4.芍药汤通过抑制NF-κB的激活及下调炎症因子水平防治结肠炎相关性结肠癌。