论文部分内容阅读
目的:从miR-29b-5p靶向TGF-β/smads信号通路调控CFs增殖、凋亡和ECM代谢的角度,探讨扶正化瘀方抗心肌纤维化可能的细胞分子机制。方法:(1)差速贴壁法提取乳鼠CFs,观察AngⅡ诱导下CFs增殖、凋亡、ECM代谢和miR-29b-5p及TGF-β/Smads的表达情况,以及扶正化瘀方的干预作用。在倒置显微镜下观察CFs细胞形态;采用CCK-8法检测CFs增殖情况;采用流式细胞仪检测CFs的凋亡情况;采用Elisa和qPCR法观察Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2的蛋白及mRNA的表达情况;采用qPCR法观察miR-29b-5p的表达情况;采用Western blot检测TGF-β1、smad2、p-smad2、smad3、p-smad3、smad4及smad7的表达变化。(2)将miR-29b-5p mimics/miR-29b-5p inhibitor 转染至CFs中,制备miR-29b-5p过表达/表达受抑细胞模型,并用扶正化瘀方对miR-29b-5p inhibitor模型进行干预。观察miR-29b-5p、TGF-β1、smad2、p-smad2、smad3、p-smad3、smad4和smad7的表达情况以及扶正化瘀方的干预作用。检测方法同上。结果:(1)与空白对照组相比,DMSO组CFs增殖没有明显变化;与空白对照组相比,Ang Ⅱ组CFs的增殖明显增多(P<0.01);与AngⅡ组相比,不同浓度FZHY组CFs增殖明显减少(P<0.05或P<0.01),且呈剂量依赖性。与空白对照组相比,AngⅡ组的早期凋亡率和总凋亡率明显减少(P<0.01);与AngⅡ组相比,FZHY组早期凋亡率和总凋亡率明显增加(P<0.01)(2)与空白对照组相比,AngⅡ组Col Ⅰ、ColⅢ、MMP2、MMP9、TIMP1和TIMP2含量及mRNA表达明显增加(P<0.05或P<0.01),MMP2/TIMP2和MMP9/TIMP1比值有降低趋势;与AngⅡ组相比,FZHY组Col Ⅰ、ColⅢ、MMP2、MMP9、TIMP1和TIMP2含量及mRNA表达明显降低,MMP2/TIMP2比值降低(P<0.05或P<0.01),MMP9/TIMP1比值有降低趋势。(3)与空白对照组相比,AngⅡ组miR-29b-5p表达明显降低(P<0.05);与AngⅡ组相比,FZHY组miR-29b-5p表达明显升高(P<0.05)。与空白对照组相比,DMSO组TGF-β1、smad2、p-smad2、smad3、p-smad3、smad4和 smad7表达量无明显变化;与空白对照组相比,AngⅡ组TGF-β1、smad2、p-smad2、smad3、p-smad3、smad4表达量明显升高,smad7表达明显降低(P<0.05或P<0.01);与AngⅡ组相比TGF-β1、p-smad2、smad3和p-smad3表达量明显降低(P<0.05或P<0.01),smad2和smad4表达量有降低趋势,smad7表达量有升高趋势。(4)与空白对照组相比,mimics阴性对照(mimics NC)组和inhibitor阴性对照(inhibitor NC)组CFs增殖无明显改变;与mimics NC组相比,转染miR-29b-5p mimics(miR-29b-5p过表达)组CFs增殖明显降低(P<0.05);与inhibitor NC组相比,miR-29b-5p inhibitor(miR-29b-5p表达受抑)组CFs增殖明显升高(P<0.01)。与空白对照组相比,mimics NC组和 inhibitor NC组TGF-β 1、smad2、p-smad2、smad3、p-smad3、smad4、smad7 表达无明显变化;与 mimics NC 组相比,miR-29b-5p mimics组TGF-β1、smad2、p-smad2、smad3、p-smad3、smad4表达明显降低(P<0.05或P<0.01),smad7表达明显升高(P<0.01);与inhibitor NC组相比,miR-29b-5p inhibitor组TGF-β1、smad2、p-smad2、smad3、p-smad3表达明显升高(P<0.05或P<0.01),smad7表达明显降低(P<0.01),smad4有升高趋势。(5)与空白对照组相比,inhibitor NC组TGF-β 1、smad2、p-smad2、smad3、p-smad3、smad4、smad7表达无明显变化;与inhibitor NC组相比,miR-29b-5p inhibitor组TGF-β1、smad2、p-smad2、smad3、p-smad3、smad4表达明显升高,smad7表达明显降低(P<0.05或P<0.01);与miR-29b-5p inhibitor组相比,FZHY组TGF-β 1、smad2、smad3、smad4表达明显降低,smad7表达明显升高(P<0.05或P<0.01),p-smad3、p-smad2有降低趋势。结论:扶正化瘀方抗心肌纤维化的细胞分子机制可能与其靶向miR-29b-5p调控TGF-β/smads信号通路介导的CFs增殖、凋亡和基质代谢有关。