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目的
本实验模拟体外脑缺血反应，研究在氧糖剥夺（OGD）以及氧糖剥夺/再灌注（OGD/R）病理条件下，星形胶质细胞源性外泌体对神经元活性及其突触可塑性的影响。通过新一代IlluminaMiSeq高通量测序技术对星形胶质细胞在OGD以及OGD/R处理条件下释放的外泌体携带的miRNAs构建了差异文库，从中筛选出阳性差异的与神经元突触可塑性相关的miRNAs。
方法
1.利用含1%胎牛血清的完全培养基加不同浓度（正常对照、10μM、15μM和20μM）的ATRA处理SH-SY5Y细胞，4天后观察SH-SY5Y细胞的增殖、轴突长度、轴突分支及细胞死亡情况，选择最佳的用药浓度，建立体外神经元模型。
2.利用WesternBlot技术，检测对照组及处理组（用含1%胎牛血清完全培养基加15μMATRA处理4天）的SH-SY5Y细胞表达突触蛋白-1（synapsin-1）和Ⅲ类β-微管蛋白（βⅢtubulin）含量水平变化。利用细胞计数法来检测正常对照组及处理组的细胞增殖情况。
3.利用MTT比色法检测2h-OGD、4h-OGD、2h-OGD/24h-R和4h-OGD/24h-R处理条件下星形胶质细胞的活性。
4.利用Hoechst33342/PI核荧光双染色法检测2h-OGD、4h-OGD、2h-OGD/24h-R和4h-OGD/24h-R处理条件下星形胶质细胞的凋亡和坏死情况。
5.利用MTT比色法检测星形胶质细胞2h-OGD、4h-OGD、2h-OGD/24h-R和4h-OGD/24h-R条件培养基及去外泌体条件培养基对神经元的活性的影响。
6.利用WesternBlot技术，检测星形胶质细胞2h-OGD、4h-OGD、2h-OGD/24h-R和4h-OGD/24h-R条件培养基及去外泌体条件培养基对神经元表达synapsin-1、βⅢtubulin和Erk信号通路蛋白含量的变化的影响。
7.利用超速离心法收集星形胶质细胞释放的外泌体，通过透射电镜（TEM）来检测外泌体形态，利用WesternBlot技术，检测外泌体标志蛋白TSG101的表达情况。
8.利用WesternBlot技术，检测星形胶质细胞2h-OGD、4h-OGD、2h-OGD/24h-R和4h-OGD/24h-R处理时释放的外泌体对神经元表达synapsin-1、βⅢtubulin和Erk信号通路蛋白含量的变化的影响。
9.将星形胶质细胞2h-OGD处理时释放的外泌体作用于神经元，利用免疫荧光染色技术，检测神经元轴突的变化情况。
10.通过IlluminaMiSeq高通量测序对星形胶质细胞在OGD以及OGD/R处理条件下释放的外泌体携带的miRNAs构建差异文库，然后对结果进行分析，从中筛选出阳性差异的与神经元突触可塑性相关的miRNAs（P＜0.05）。
结果
1.用含1%胎牛血清的完全培养基加15μMATRA处理4天的SH-SY5Y细胞表现出更佳的神经元分化和功能表型及表达更高的神经元标记蛋白synapsin-1和βⅢtubulin水平，所以，以此作为神经元模型用于后续实验。
2.2h-OGD和2h-OGD/24h-R对星形胶质细胞的活性没有显著影响，不引起星形胶质细胞的凋亡和坏死；而4h-OGD和4h-OGD/24h-R显著下调星形胶质细胞的活性，促进星形胶质细胞凋亡性死亡。
3.星形胶质细胞2h-OGD、4h-OGD、2h-OGD/24h-R和4h-OGD/24h-R条件培养基及释放的外泌体能够逆转相应OGD或者OGD/R诱导的神经元活性的下调。
4.2h-OGD、4h-OGD及分别再灌注24h处理条件下，星形胶质细胞条件培养基能够逆转OGD或OGD/R诱导的神经元synapsin-1蛋白和p-Erk1+p-Erk2蛋白表达的下调；而相应的去外泌体星形胶质细胞条件培养基却不能逆转OGD或OGD/R诱导的神经元synapsin-1蛋白和p-Erk1+p-Erk2蛋白的表达下调。
5.通过TEM和WesternBlot凝胶电泳技术证明星形胶质细胞会释放外泌体到细胞外基质中。
6.正常培养条件下星形胶质细胞外泌体及2h-OGD、4h-OGD及分别再灌注24h处理条件下星形胶质细胞外泌体均能上调相应条件下神经元synapsin-1蛋白的表达以及p-Erk1+p-Erk2的磷酸化水平。
7.星形胶质细胞2h-OGD处理时释放的外泌体对神经元的轴突生长具有保护作用。
8.通过对正常对照组、4h-OGD组以及4h-OGD/24h-R组星形胶质细胞外泌体miRNAs表达差异的分析，发现与对照组相比，4h-OGD组分别有6条和1条与调节神经元突触可塑性相关的miRNAs下调和上调，其中miR-450b-3p_R+1表达显著下调，且与synapsin-1蛋白表达相关；而4h-OGD/24h-R组中有5条与调节神经元突触可塑性相关的miRNAs显著下调，其中miR-450b-3p_R+1和miR-193b-5p_L+1R+3与synapsin-1蛋白表达相关。
结论
1.2h-OGD、4h-OGD、2h-OGD/24h-R及4h-OGD/24h-R处理条件下，星形胶质细胞外泌体对相应的OGD或OGD/R诱导的神经元损伤具有保护作用。
2.星形胶质细胞外泌体在正常培养、OGD及OGD/R条件下上调神经元突触前膜蛋白synapsin-1的表达，且此种作用可能是通过调节Erk信号通路实现的。
3.4h-OGD及4h-OGD/24h-R改变星形胶质细胞外泌体miRNA表达谱，其中部分miRNAs参与神经元突触可塑性的调节，包括对突触前膜蛋白synapsin-1的表达调节。
4.星形胶质细胞外泌体可能通过miRNA及某种可调节共培养神经元Erk信号通路的不同途径参与调节缺血条件下神经元的突触可塑性。
本实验模拟体外脑缺血反应，研究在氧糖剥夺（OGD）以及氧糖剥夺/再灌注（OGD/R）病理条件下，星形胶质细胞源性外泌体对神经元活性及其突触可塑性的影响。通过新一代IlluminaMiSeq高通量测序技术对星形胶质细胞在OGD以及OGD/R处理条件下释放的外泌体携带的miRNAs构建了差异文库，从中筛选出阳性差异的与神经元突触可塑性相关的miRNAs。
方法
1.利用含1%胎牛血清的完全培养基加不同浓度（正常对照、10μM、15μM和20μM）的ATRA处理SH-SY5Y细胞，4天后观察SH-SY5Y细胞的增殖、轴突长度、轴突分支及细胞死亡情况，选择最佳的用药浓度，建立体外神经元模型。
2.利用WesternBlot技术，检测对照组及处理组（用含1%胎牛血清完全培养基加15μMATRA处理4天）的SH-SY5Y细胞表达突触蛋白-1（synapsin-1）和Ⅲ类β-微管蛋白（βⅢtubulin）含量水平变化。利用细胞计数法来检测正常对照组及处理组的细胞增殖情况。
3.利用MTT比色法检测2h-OGD、4h-OGD、2h-OGD/24h-R和4h-OGD/24h-R处理条件下星形胶质细胞的活性。
4.利用Hoechst33342/PI核荧光双染色法检测2h-OGD、4h-OGD、2h-OGD/24h-R和4h-OGD/24h-R处理条件下星形胶质细胞的凋亡和坏死情况。
5.利用MTT比色法检测星形胶质细胞2h-OGD、4h-OGD、2h-OGD/24h-R和4h-OGD/24h-R条件培养基及去外泌体条件培养基对神经元的活性的影响。
6.利用WesternBlot技术，检测星形胶质细胞2h-OGD、4h-OGD、2h-OGD/24h-R和4h-OGD/24h-R条件培养基及去外泌体条件培养基对神经元表达synapsin-1、βⅢtubulin和Erk信号通路蛋白含量的变化的影响。
7.利用超速离心法收集星形胶质细胞释放的外泌体，通过透射电镜（TEM）来检测外泌体形态，利用WesternBlot技术，检测外泌体标志蛋白TSG101的表达情况。
8.利用WesternBlot技术，检测星形胶质细胞2h-OGD、4h-OGD、2h-OGD/24h-R和4h-OGD/24h-R处理时释放的外泌体对神经元表达synapsin-1、βⅢtubulin和Erk信号通路蛋白含量的变化的影响。
9.将星形胶质细胞2h-OGD处理时释放的外泌体作用于神经元，利用免疫荧光染色技术，检测神经元轴突的变化情况。
10.通过IlluminaMiSeq高通量测序对星形胶质细胞在OGD以及OGD/R处理条件下释放的外泌体携带的miRNAs构建差异文库，然后对结果进行分析，从中筛选出阳性差异的与神经元突触可塑性相关的miRNAs（P＜0.05）。
结果
1.用含1%胎牛血清的完全培养基加15μMATRA处理4天的SH-SY5Y细胞表现出更佳的神经元分化和功能表型及表达更高的神经元标记蛋白synapsin-1和βⅢtubulin水平，所以，以此作为神经元模型用于后续实验。
2.2h-OGD和2h-OGD/24h-R对星形胶质细胞的活性没有显著影响，不引起星形胶质细胞的凋亡和坏死；而4h-OGD和4h-OGD/24h-R显著下调星形胶质细胞的活性，促进星形胶质细胞凋亡性死亡。
3.星形胶质细胞2h-OGD、4h-OGD、2h-OGD/24h-R和4h-OGD/24h-R条件培养基及释放的外泌体能够逆转相应OGD或者OGD/R诱导的神经元活性的下调。
4.2h-OGD、4h-OGD及分别再灌注24h处理条件下，星形胶质细胞条件培养基能够逆转OGD或OGD/R诱导的神经元synapsin-1蛋白和p-Erk1+p-Erk2蛋白表达的下调；而相应的去外泌体星形胶质细胞条件培养基却不能逆转OGD或OGD/R诱导的神经元synapsin-1蛋白和p-Erk1+p-Erk2蛋白的表达下调。
5.通过TEM和WesternBlot凝胶电泳技术证明星形胶质细胞会释放外泌体到细胞外基质中。
6.正常培养条件下星形胶质细胞外泌体及2h-OGD、4h-OGD及分别再灌注24h处理条件下星形胶质细胞外泌体均能上调相应条件下神经元synapsin-1蛋白的表达以及p-Erk1+p-Erk2的磷酸化水平。
7.星形胶质细胞2h-OGD处理时释放的外泌体对神经元的轴突生长具有保护作用。
8.通过对正常对照组、4h-OGD组以及4h-OGD/24h-R组星形胶质细胞外泌体miRNAs表达差异的分析，发现与对照组相比，4h-OGD组分别有6条和1条与调节神经元突触可塑性相关的miRNAs下调和上调，其中miR-450b-3p_R+1表达显著下调，且与synapsin-1蛋白表达相关；而4h-OGD/24h-R组中有5条与调节神经元突触可塑性相关的miRNAs显著下调，其中miR-450b-3p_R+1和miR-193b-5p_L+1R+3与synapsin-1蛋白表达相关。
结论
1.2h-OGD、4h-OGD、2h-OGD/24h-R及4h-OGD/24h-R处理条件下，星形胶质细胞外泌体对相应的OGD或OGD/R诱导的神经元损伤具有保护作用。
2.星形胶质细胞外泌体在正常培养、OGD及OGD/R条件下上调神经元突触前膜蛋白synapsin-1的表达，且此种作用可能是通过调节Erk信号通路实现的。
3.4h-OGD及4h-OGD/24h-R改变星形胶质细胞外泌体miRNA表达谱，其中部分miRNAs参与神经元突触可塑性的调节，包括对突触前膜蛋白synapsin-1的表达调节。
4.星形胶质细胞外泌体可能通过miRNA及某种可调节共培养神经元Erk信号通路的不同途径参与调节缺血条件下神经元的突触可塑性。