背景:慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染仍是世界性的公共卫生问题,是导致肝硬化、肝细胞癌等终末期肝病的重要原因。宿主HBV特异性T细胞免疫应答在病毒的控制清除和肝脏炎症损伤中发挥着核心作用,决定了HBV感染的最终转归。急性自限性HBV感染时,机体具备强烈、广泛、多克隆的特异性T细胞应答,并在病毒清除后形成免疫记忆。但是,慢性HBV感染时,由于高浓度HBV抗原刺激等原因,HBV特异性T细胞呈现数量减少和功能耗竭,从而导致了持续感染。T细胞耗竭主要表现为分泌效应细胞因子、细胞增殖等功能障碍和细胞凋亡增加。目前认为,引起HBV特异性T细胞耗竭的主要机制包括:暴露于高病毒抗原中、程序性死亡受体1等共抑制分子表达上调、抑制性细胞因子分泌增多和调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)的抑制作用等等。因此,最大程度恢复耗竭的HBV特异性T细胞功能是清除慢性HBV感染的关键。1型调节性T细胞(type 1 regulatory T cells,Tr1)是一种由外周CD4~+T细胞经抗原诱导分化而来,具有促进机体免疫耐受和维持免疫稳态功能的细胞亚群。Tr1的表型为共表达整合素α2β1(integrinα2β1,CD49b)和淋巴细胞活化基因3(lymphocyte activation gene-3,LAG-3)的记忆性CD4~+T细胞,并具有特有的细胞因子表达谱和代谢转录组学特点。目前认为,Tr1主要通过分泌高浓度白细胞介素(interleukin,IL)10和释放颗粒酶B介导特异性抗原抑制功能,并广泛参与了自身免疫病、移植物排异、病原体感染和肿瘤细胞免疫逃逸T细胞介导的疾病。在HBV小鼠模型中,肝内HBV特异性Tr1通过分泌IL-10,抑制淋巴结生发中心内滤泡辅助性T细胞和B细胞的成熟,从而介导了HBV特异性免疫耐受。虽然有研究发现HBV特异性IL-10+Tr1不能作为区分HBV自然史不同分期的免疫标记,但用IL-10+细胞定义Tr1存在方法学上的不足,故难以真实反映Tr1在慢性HBV感染中的实际意义。因此,探索Tr1对HBV特异性T细胞应答的抑制作用和机制,寻找潜在的恢复T细胞耗竭的免疫调节治疗靶点具有重要意义。第一部分tr1在慢性hbv感染自然史和抗病毒治疗中的变化及意义目的:横断面比较慢性hbv感染自然史不同时期患者外周血和肝内tr1频率的差异及组织分布特点,分析其与hbvdna、病毒抗原水平、肝脏炎症和纤维化程度等临床指标间的关系,并纵向观察抗病毒治疗对tr1数量的影响,以期揭示tr1在慢性hbv感染中可能具有的临床意义。方法:1横断面研究中入选未经抗病毒治疗的慢性hbv感染者共110例,包括免疫耐受(immunetolerant,it)期21例,hbeag+免疫活动(immuneactive,ia)期46例,非活动性携带(inactivecarrier,ic)期24例,hbeag–ia期19例。同时纳入23例健康志愿者作为健康对照。纵向研究纳入15例接受聚乙二醇干扰素α2a联合恩替卡韦初始抗病毒治疗的hbeag+ia期患者。慢性hbv感染的诊断需符合2015年美国肝病学会颁布的《慢性乙型肝炎治疗指南》的标准。所有研究对象留取外周抗凝血,部分患者接受肝组织活检。2检测血清病毒学标志物、hbvdna、hbv基因型、肝生化学等临床指标。肝组织病理切片经h&e和masson染色后,利用knodell和ishak评分对炎症活动和纤维化进行评估。3从血液和肝组织标本中分离外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells,pbmc)和肝内淋巴细胞(intrahepaticlymphocyte,ihl)。应用多色流式细胞术检测pbmc和ihl中cd49b~+lag-3~+tr1的频率,并分析其与临床指标的相关性。4利用免疫组织化学染色技术观察肝内lag-3在慢性hbv感染自然史各期患者中的表达差异和分布位置特点,并进一步探讨lag-3与cd4分子的空间依存关系。结果:1横断面研究对象的人口学和临床资料所有入选患者感染hbv均为基因b型或c型。it期和hbeag+ia期患者相对于ic期和hbeag–ia期患者更年轻。it期和ic期患者血清丙氨酸氨基转移酶(alanineaminotransferase,alt)正常,肝脏无明显炎症,但hbeag+ia和hbeag–ia期患者出现不同程度的alt升高,肝组织可见明显的炎症和不同程度的纤维化。it期和hbeag+ia期患者hbvdna复制活跃,ic期患者hbvdna处于低复制或不可测水平。ic期患者的血清hbsag水平较it期和hbeag+ia患者显著下降,而hbeag–ia期患者介于三者之间。2外周血cd49b~+lag-3~+tr1频率及与临床指标的相关性慢性hbv感染者外周血cd49b~+lag-3~+tr1频率显著高于健康对照者(p<0.0001)。ic期患者外周血tr1频率显著低于it期和hbeag+ia期患者(均p<0.0001)。tr1频率在it期和hbeag+ia期患者间无统计学差异,但两者均显著高于hbeag–ia期患者(p=0.004和p=0.005)。根据hbeag状态分层,hbeag+患者外周血tr1明显高于hbeag–患者(p<0.0001)。此外,未发现tr1频率存在性别间的差异。相关性分析显示,外周血tr1频率与血清hbvdna和hbsag水平呈正相关(r=0.543,p<0.001和r=0.582,p<0.001),但与血清alt、hbeag水平和肝组织炎症、纤维化评分无相关性。3肝内tr1的频率及lag-3、cd4分子的空间定位关系tr1在慢性hbv感染者ihl中的频率明显高于pbmc(p=0.005)。免疫组化显示,ic期患者肝内lag-3表达显著少于hbeag+ia期、hbeag–ia期和it期患者,主要表达在汇管区、小叶内的炎症坏死灶和肝窦内,连续切片亦发现cd4和lag-3分子的阳性表达在同一区域内有部分重叠。4外周血tr1频率在抗病毒治疗过程中的变化趋势在接受抗病毒治疗的15例患者中,外周血tr1频率在治疗48周时较基线和12周有明显下降(p=0.01和p=0.03)。治疗48周时,外周血tr1与治疗前的差值,在hbsag较基线下降≥0.5log的患者中显著高于hbsag下降<0.5log的患者(p=0.018)。同时,tr1在治疗期间的下降幅度与hbsag下降幅度具有相关性(r=0.662,p=0.007)。小结:1慢性hbv感染者外周血tr1数量增加,提示tr1可能在hbv持续性感染的形成中发挥了一定作用。2tr1在慢性hbv感染自然史不同分期间具有显著差异,尤其在it和hbeag+ia期显著高于ic期,反映了病毒复制能力和宿主免疫耐受程度,可作为临床判别自然史分期的一个较有意义的免疫学标志物。3chb患者抗病毒治疗中,tr1的下降与病毒抑制后hbsag的降低具有一定联系,故有可能成为潜在的预测抗病毒治疗应答的免疫学指标。第二部分慢性hbv感染者外周血tr1的细胞因子表达谱目的:分析tr1在慢性hbv感染背景下的细胞因子表达谱特点。方法:利用流式分选hbeag+ia期患者外周血cd49b~+lag-3~+tr1、cd4+cd45ra–cd49b–lag-3–t和cd4~+cd45ra~+t共三群细胞,在体外经佛波醇酯和离子霉素刺激后,利用流式多因子技术检测上清液中il-4、il-10、il-17a、干扰素γ(interferonγ,ifn-γ)和肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactorα,tnf-α)的水平。结果:cd49b~+lag-3~+tr1分泌il-10的水平显著高于cd49b–lag-3–t细胞(p=0.02)和cd4~+cd45ra~+t细胞(p=0.03),但在后两者间无统计学差异。ifn-γ分泌水平在cd49b~+lag-3~+tr1中显著低于cd49b–lag-3–t细胞(p=0.02),然而与cd4~+cd45ra~+t细胞比较无统计学差异。cd49b~+lag-3~+tr1能分泌少量的tnf-α、il-17a和il-4,均显著低于cd49b–lag-3–t细胞(p=0.01;p=0.0002;p=0.001),但cd4~+cd45ra~+t细胞不分泌或仅分泌低水平的il-17a和il-4。聚类分析也证实,基于该细胞因子表达谱可以将tr1与cd49b–lag-3–t细胞和cd4~+cd45ra~+t细胞进行区分。小结:1慢性hbv感染者外周血cd49b~+lag-3~+tr1具有以分泌il-10为主的细胞因子谱,并显著区别于其它记忆性和初始cd4+t细胞亚群。2tr1分泌的il-10可能参与调控慢性hbv感染免疫应答,但尚需进一步研究证实。第三部分tr1对hbv特异性t细胞的抑制功能和机制目的:评价tr1对hbv特异性t细胞分泌细胞因子和细胞增殖功能的影响,并探索il-10作为可能机制在tr1介导的hbv特异性t细胞功能抑制中发挥的作用。方法:利用流式分选技术将hbeag+ia期患者外周血cd49b~+lag-3~+tr1从pbmc中删除,剩余细胞命名为反应细胞(respondercells,rc),并进一步分为rc+tr1和rc两组,在体外经hbv抗原肽库或cef抗原肽库(来自巨细胞病毒、eb病毒和流感病毒)刺激进行富集培养。用酶联免疫斑点测定(enzyme-linkedimmunospotassay,elisopt)技术和胞内细胞因子染色(intracellularcytokinestaining,ics)技术检测cd4+t细胞和cd8+t细胞分泌ifn-γ和tnf-α的水平,同时用cfse染色观察cd8+t细胞的增殖能力,评价tr1对hbv特异性t细胞功能的抑制作用。此外,利用il-10抗体阻断技术,探索tr1对hbv特异性t细胞分泌细胞因子和细胞增殖功能的影响。结果:1tr1对hbv特异性cd8+t细胞分泌ifn-γ和tnf-α的抑制作用elispot结果显示,经hbv抗原肽库刺激后,rc中ifn-γ+细胞斑点数较rc+tr1明显增多,差异具有统计学意义(p=0.014)。ics结果进一步发现,rc中hbv特异性ifn-γ+cd8+t细胞和tnf-α+cd8+t细胞频率较rc+tr1明显增多,差异具有统计学意义(p=0.006和p=0.034),但是删除tr1后并未显著提升hbv特异性cd4+t细胞分泌ifn-γ和tnf-α的功能。此外,tr1经cef抗原肽库刺激后,cd4+t细胞和cd8+t细胞分泌细胞因子的功能在rc与rc+tr1间无显著差异。2tr1对cd8+t细胞增殖的抑制作用cfse增殖实验的结果显示,删除tr1后rc中cd8+t细胞的未增殖率较rc+tr1显著降低,差异具有统计学意义(p=0.009)。我们进一步选取1例慢性hbv感染者,分选其外周血tr1和cd8+t细胞,并将两者按0:1、1:4、1:2等不同比例进行共培养,结果发现cd8+t细胞的增殖指数逐渐降低,依次为3.00、1.85和1.45,提示tr1对cd8+t细胞的抑制作用具有剂量依赖性。3阻断il-10能部分恢复tr1对cd8+t细胞功能的抑制作用经il-10抗体阻断后,hbv特异性cd8+t细胞分泌ifn-γ和tnf-α较同型对照明显增多(均p<0.05),这种阻断效应尤其在rc+tr1中较rc更为显著(ifn-γ升高倍数:1.73±0.53vs1.16±0.10,p=0.01;tnf-α升高倍数:1.94±1.10vs1.46±0.50,p=0.039),而cef抗原肽库刺激虽能部分增强cd8+t细胞分泌ifn-γ和tnf-α的能力(均p<0.05),但改善程度在两组间无显著差异,提示tr1分泌的il-10对hbv特异性cd8+t细胞分泌ifn-γ和tnf-α具有抑制作用。此外,无论是在rc+tr1还是rc中,il-10阻断使cd8+t细胞的未增殖率较同型对照均显著降低(均p=0.006)。虽然il-10阻断在rc+tr1中的恢复程度高于rc,但尚不具有统计学差异。小结:1慢性hbv感染者外周血tr1能显著抑制hbv特异性cd8+t细胞的细胞因子分泌和增殖功能。2特异性阻断il-10能部分恢复tr1对hbv特异性cd8+t细胞功能的抑制作用。第四部分慢性hbv感染时cd49b在cd8+t细胞上的表达及意义目的:观察慢性hbv感染者外周血和肝内cd49b+cd8+t细胞的表达数量及与疾病间的关系,并分析其活化和记忆性的特点。方法:基于第一部分研究中的横断面自然史队列,纳入慢性hbv感染者76例(it期12例、hbeag+ia期25例、ic期23例和hbeag–ia期16例)和健康对照者23例。利用流式细胞术检测pbmc和ihl中cd49b+cd8+t细胞的频率及其与临床指标的相关性,分析cd49b+cd8+t细胞中cd45a表达与cd49b–cd8+t和总cd8+t细胞的表达差异。利用免疫组织化学染色技术观察肝内cd49b的表达定位和与cd8的空间关系。结果:1慢性hbv感染自然史各期患者外周血cd49b+cd8+t细胞频率慢性hbv感染者外周血cd49b+cd8+t细胞占cd3+cd8+t细胞频率高于健康对照者(p=0.0003)。hbeag+ia期和hbeag–ia期患者,外周血cd49b+cd8+t细胞频率均显著高于it期(p=0.002和p=0.004)和ic期(p=0.016和p=0.027),但前两者间和后两者间分别比较均无统计学差异。此外,具有肝炎活动的患者(hbeag+ia期和hbeag–ia期),与无炎症活动的患者(it期和ic期)比较,外周血cd49b+cd8+t细胞频率在前者显著高于后者(p=0.0003)。根据hbeag状态和性别分层,未见cd49b+cd8+t细胞频率有统计学差异。2外周血cd49b+cd8+t细胞频率与临床指标的相关性外周血cd49b+cd8+t细胞频率与血清alt和天冬氨酸氨基转移酶水平正相关(r=0.39,p=0.0005和r=0.32,p=0.005),但与血清hbvdna和hbsag水平无相关性。此外,在接受肝活检的患者中,外周血cd49b+cd8+t细胞频率与肝脏knodell评分(r=0.497,p=0.001)和ishak评分(r=0.353,p=0.025)正相关。3cd49b+cd8+t细胞表达cd45ra的水平在hbeag+ia期患者中,cd49b+cd8+t细胞中cd45ra+t细胞频率显著低于cd8+cd49b–t细胞(p=0.022)和总cd8+t细胞(p=0.025)。此外,cd45ra–t细胞与cd45ra+t细胞频率的比值在cd49b+cd8+t细胞中显著高于cd8+cd49b–t细胞(p=0.026)和总cd8+t细胞(p=0.015)。4cd49b+cd8+t细胞在肝内的数量及分布特点cd49b+cd8+t细胞在ihl中的频率显著高于pbmc(p=0.0007)。免疫组化显示,hbeag+ia期和hbeag–ia期患者肝内cd49b表达显著增多,而it期和ic期患者则仅有少许表达。cd49b的表达部位主要在炎症细胞聚集的汇管区、小叶内的炎症坏死灶中,同时可观察到有类似纤维组织从汇管区向小叶内延伸的现象;连续肝组织切片可检测到cd49b和cd8阳性表达出现在同一区域内,提示两者可能存在共表达现象。小结:1慢性hbv感染者外周血cd49b+cd8+t细胞增多,与肝脏炎症损伤程度密切相关,同时具有从外周向肝内迁移的特点,但具体机制仍需进一步探讨。2慢性hbv感染患者增多的cd49b+cd8+t细胞主要为活化或记忆性cd8+t细胞。结论:1慢性hbv感染自然史不同分期患者tr1的数量和分布具有差异,并反映了病毒复制能力和宿主免疫耐受程度,有可能成为临床判别自然史分期的一个潜在的有意义的免疫学标志物。2慢性hbv感染者外周血tr1具有以分泌il-10为主,并具有明显区别于其它初始和记忆性cd4+t细胞亚群的细胞因子表达谱。3tr1通过分泌il-10介导了hbv特异性t细胞的功能抑制,可能是慢性hbv感染后免疫耐受形成的机制之一。4靶向阻断tr1的抑制作用有可能成为逆转hbv特异性t细胞功能耗竭的潜在免疫治疗策略。5 CD49b是具有抑制性细胞Tr1的重要表面标记,但表达CD49b的CD8+T细胞在慢性HBV感染时主要介导肝脏的免疫病理损伤。