目的:沙门菌质粒毒力基因spvC具有磷酸苏氨酸裂解酶活性,可通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号传导通路抑制肠道炎症反应,促进细菌全身播散。课题组前期研究发现该作用与其抑制巨噬细胞焦亡密切相关。本研究旨在探究spvC影响巨噬细胞焦亡的机制,为控制沙门菌感染提供新的靶点,并为其他相应疾病治疗提供新的思路。本研究第一部分利用鼠伤寒沙门菌与巨噬细胞共培养建立感染模型,探讨spvC抑制巨噬细胞焦亡与MAPK信号传导通路、焦亡相关炎性小体3(nucleotide-binding oligomerization domain,leucine-richrepeatandpyrindomain-containing3,NLRP3)、炎性小体 4(NLRwith CARD domain-containing 4,NLRC4)及凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)寡聚的关系。第二部分利用CRISPR/Cas9系统构建敲除焦亡关键蛋白gasdermin D(GSDMD)的巨噬细胞gsdmd-/-RAW 264.7,为后续深入研究GSDMD介导的巨噬细胞死亡对宿主抗感染免疫应答的影响及其机制奠定基础。方法:一、沙门菌质粒毒力基因spvC抑制巨噬细胞焦亡与MAPK信号通路及炎性小体的相关性研究本部分研究利用鼠伤寒沙门菌野生株SL1344(STM-WT)和课题组构建的SL1344spvC基因敲除突变株及spvC回补株(STM-ΔspvC及STM-c-spvC)与小鼠巨噬细胞(J774A.1 和 RAW 264.7)分别以感染复数(multiplicity of infection,MOI)10:1共培养,于不同时间点收集细胞进行实验。1 spvC对巨噬细胞超微结构的影响课题组前期通过Wright Giemsa染色和活细胞工作站观察发现spvC可影响沙门菌感染所致巨噬细胞形态变化,在此基础上将三株受试菌分别与J774A.1细胞共培养16 h和24h。制备超薄切片,利用透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)分析不同感染组细胞超微结构变化。2 spvC抑制巨噬细胞MAPK信号通路对NLRP3、NLRC4的影响2.1沙门菌质粒毒力基因spvC对巨噬细胞MAPK信号传导通路的影响文献报道纯化的SpvC蛋白可使巨噬细胞中MAPK信号传导通路的细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK)及 c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)失活,为探究感染沙门菌的巨噬细胞中spvC对MAPK的影响,将三株受试菌分别与J774A.1细胞共培养,于不同时间点提取各感染组全细胞裂解液总蛋白,Western blot检测MAPK信号传导通路中关键蛋白ERK、JNK和p38的磷酸化水平。2.2沙门菌质粒毒力基因spvC对炎性小体NLRP3、NLRC4的影响课题组既往用沙门菌感染的巨噬细胞发现spvC可在感染后期抑制与细胞焦亡密切相关的炎性小体NLRP3和NLRC4表达,为进一步探究spvC在沙门菌感染巨噬细胞前期的生物学效应,将三株受试菌分别与过夜培养至对数生长期的J774A.1细胞共作用,在感染后2 h、4 h和8 h提取各感染组全细胞裂解液总蛋白,Western blot检测焦亡相关蛋白NLRP3和NLRC4的水平。2.3沙门菌质粒毒力基因spvC影响MAPK信号传导通路及其与炎性小体NLRP3、NLRC4 的关系为探究spvC对焦亡相关蛋白NLRP3、NLRC4蛋白的影响是否与其对MAPK信号传导通路的作用相关,分别用ERK抑制剂、JNK抑制剂及p38抑制剂预处理J774A.1细胞3 h后与三株受试菌共培养8 h,未用抑制剂预处理的实验组作为对照组。提取各组细胞总蛋白,Western blot检测NLRP3及NLRC4蛋白水平。3 spvC抑制巨噬细胞焦亡与经典炎性小体活化相关蛋白ASC的关系已证实NLRP3依赖ASC构成炎性小体复合物,并可通过经典及非经典活化途径介导细胞焦亡;而NLRC4炎性小体复合物则仅可通过经典活化途径介导焦亡,且ASC并非NLRC4炎性小体复合物发挥效应所必须。本部分为进一步明确NLRP3、NLRC4及ASC在spvC抑制巨噬细胞焦亡中的作用,进行相关实验。3.1沙门菌质粒毒力基因spvC对ASC的影响3.1.1 qPCR及Western blot分别检测ASC的转录水平及蛋白单体水平将三株受试菌分别与J774A.1细胞共培养2h、8h、16h和24h,提取各感染组细胞总RNA,qPCR检测asc转录水平;提取全细胞裂解液总蛋白,Western blot检测ASC单体水平。3.1.2荧光显微镜观察寡聚形成的ASC斑点聚集三株受试菌分别与J774A.1细胞共培养,FITC及Hochest染色后荧光显微镜观察各感染组细胞ASC斑点聚集情况。3.2沙门菌质粒毒力基因spvC对缺失ASC蛋白的巨噬细胞焦亡的影响3.2.1 Western blot检测巨噬细胞RAW 264.7及J774A.1的ASC蛋白水平提取巨噬细胞RAW 264.7及J774A.1全细胞裂解液总蛋白,Western blot检测ASC蛋白单体水平。3.2.2 Western blot检测沙门菌感染后RAW 264.7细胞中焦亡相关蛋白GSDMD 及 GSDMD-NT 水平受试菌与 RAW 264.7 细胞共培养 2 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h 和 24 h,Western blot检测全细胞裂解液和培养基上清中GSDMD及GSDMD-NT水平。二、利用CRISPR/Cas9系统构建基因敲除巨噬细胞gsdmd-/-RAW 264.71 gsdmd-/-RAW 264.7细胞的构建和鉴定1.1 pGL3-sgRNA重组载体构建根据 CRISPR/Cas9 系统中向导 RNA(singleguide RNA,sgRNA)设计原则,针对gsdmd基因3号外显子靶向设计4条gRNA,以pUC57质粒作为模板,PCR扩增含U6启动子的sgRNA片段;用限制性内切酶BsmBI单酶切PCR扩增产物和pGL3质粒;利用T4DNALigase将sgRNA扩增片段的酶切产物与线性pGL3质粒连接并转化,获得重组质粒载体pGL3-sgRNA,PCR扩增及测序鉴定载体的构建。1.2构建RAW 264.7-Cas9细胞并鉴定电穿孔法将Cas9质粒转染RAW 264.7细胞,连续传代三次后qPCR鉴定cas9转录水平。1.3构建gsdmd-/-RAW 264.7细胞并鉴定电穿孔法将pGL3-sgRNA重组载体转染RAW264.7-Cas9细胞,PCR扩增及测序鉴定gsdmd基因,Western blot检测GSDMD蛋白表达。2 GSDMD介导的spvC对RAW 264.7细胞死亡的影响三株受试菌分别与野生型及gsdmd-/-RAW 264.7共培养24h后,利用比色法检测细胞乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放水平,探讨沙门菌质粒毒力基因spvC介导的沙门菌所致巨噬细胞死亡与GSDMD的关系。结果:一、沙门菌质粒毒力基因spvC抑制巨噬细胞焦亡与MAPK信号通路及炎性小体的相关性研究1 spvC对巨噬细胞超微结构的影响透射电镜结果表明,随着感染时间延长,巨噬细胞J774A.1中沙门菌大量繁殖,破坏细胞正常结构。感染后期(16-24 h),spvC敲除株感染组细胞结构破坏严重,胞质疏松,细胞内容物流出,形成孔诱导的胞内馅阱(pore-induced intracellular traps,PITs),回补株感染组中可见细胞膜破损,有形成焦亡孔道趋势,发现spvC可影响巨噬细胞PITs形成。2 spvC抑制巨噬细胞MAPK信号通路对NLRP3、NLRC4的影响2.1沙门菌质粒毒力基因spvC对MAPK信号传导通路的影响Western blot结果显示感染后16h,携带spvC的感染组J774A.1细胞中ERK、JNK和p38磷酸化水平均低于敲除株感染组,证明在感染沙门菌的巨噬细胞中,spvC可抑制MAPK信号传导通路。2.2沙门菌质粒毒力基因spvC对炎性小体NLRP3和NLRC4的影响Western blot结果显示,携带spvC沙门菌感染的巨噬细胞J774A.1在感染后8h,NLRP3及NLRC4的蛋白水平均低于敲除株感染组,提示spvC对焦亡相关蛋白NLRP3及NLRC4的活化有抑制作用。2.3沙门菌质粒毒力基因spvC影响MAPK信号传导通路及其与炎性小体NLRP3、NLRC4 的关系Western blot结果显示,未加MAPK抑制剂预处理的敲除株感染组NLRP3及NLRC4的蛋白水平均高于携带spvC的感染组,抑制剂(PD98059、SP600125、SB203580)预处理后三株菌感染组NLRP3及NLRC4蛋白水平显著降低,表明spvC经由MAPK信号传导通路抑制焦亡相关蛋白NLRP3、NLRC4表达。3 spvC抑制巨噬细胞焦亡与经典炎性小体活化相关蛋白ASC的关系3.1沙门菌质粒毒力基因spvC对ASC的影响3.1.1 qPCR及Western blot分别检测ASC的转录水平及蛋白单体水平qPCR结果显示感染早期(2-8 h)asc转录水平较高,携带spvC的感染组asc转录水平低于敲除株感染组;但Western blot检测结果显示不同时间点各感染组ASC的蛋白单体水平无显著性差异。3.1.2荧光显微镜观察ASC寡聚形成的ASC斑点聚集荧光显微镜结果显示,未感染组细胞中未见ASC寡聚形成的ASC斑点,沙门菌感染组可见细胞内形成的ASC斑点,但三株菌感染组中ASC斑点数量无统计学差异,表明沙门菌感染可激活巨噬细胞中ASC寡聚,但spvC对ASC寡聚无明显影响。3.2沙门菌质粒毒力基因spvC对缺失ASC蛋白的巨噬细胞焦亡的影响3.2.1 Western blot检测巨噬细胞RAW 264.7及J774A.1中的ASC蛋白水平Western blot结果证实RAW 264.7细胞不表达ASC蛋白,J774A.1细胞中则可检测到ASC蛋白。3.2.2 Western blot检测RAW264.7细胞中焦亡相关蛋白GSDMD及GSDMD-NT水平Western blot结果表明巨噬细胞RAW 264.7中各感染组GSDMD-NT的蛋白水平随时间升高,携带spvC细菌感染组全细胞裂解液及培养基上清中GSDMD-NT均低于敲除株感染组,感染后期差异显著。鉴于RAW 264.7细胞无ASC蛋白表达,上述结果提示spvC抑制巨噬细胞焦亡可能与ASC无关。已知NLRP3介导的细胞焦亡离不开ASC的参与,推测spvC抑制巨噬细胞经典焦亡途径与炎性小体NLRC4有关。二、利用CRISPR/Cas9系统构建基因敲除巨噬细胞gsdmd--RAW264.71 gsdmd-/-RAW 264.7细胞的构建和鉴定1.1 pGL3-sgRNA重组载体构建PCR鉴定及测序结果表明pGL3-sgRNA重组载体构建成功。1.2构建RAW 264.7-Cas9细胞并鉴定qPCR结果显示,与对照组相比,经Cas9质粒电转后RAW 264.7细胞可稳定表达有功能的Caas9基因。1.3构建gsdmd-/-RAW 264.7细胞并鉴定PCR扩增及测序结果表明sgRNA打靶区域gsdmd基因的3号外显子成功敲除,Western blot检测目标细胞中GSDMD蛋白不表达,表明gsdmd-/-RAW 264.7细胞构建成功。2 GSDMD介导的spvC对RAW 264.7细胞死亡的影响比色法检测细胞LDH释放水平,结果显示野生型RAW 264.7细胞与三株受试菌共培养24 h后,携带spvC感染组LDH释放水平显著低于敲除株感染组。敲除gsdmd基因后,RAW 264.7各感染组LDH释放水平无明显差别,但较野生型RAW264.7感染后释放的LDH均显著降低,表明沙门菌质粒毒力基因spvC可抑制gsdmd介导的巨噬细胞死亡。结论:1.沙门菌质粒毒力基因spvC影响巨噬细胞PITs形成。2.沙门菌质粒毒力基因spvC通过MAPK信号传导通路抑制巨噬细胞焦亡相关蛋白NLRP3及NLRC4的水平。3.沙门菌质粒毒力基因spvC对巨噬细胞焦亡经典途径的抑制作用可能与其影响ASC非依赖的NLRC4炎性小体活化密切相关。4.利用CRISPR/Cas9系统成功构建gsdmd-/-RAW 264.7细胞,为后续深入研究spvC与GSDMD介导的巨噬细胞死亡奠定了基础。