研究背景急性冠脉综合征(acute coronary syndromes, ACS)作为冠心病(coronary heart disease, CHD)的一种急危重症,是中老年人的常见杀手之一,严重危害着中老年人的健康。ACS是包括不稳定型心绞痛(unstable angina pectoris, UAP)、ST段抬高心肌梗死和非ST段抬高心肌梗死的一组临床综合症。一般认为,引起ACS发生的主要病理生理过程为易损斑块(vulnerable plaque, VP)的溃疡或者破裂而继发的血栓形成,引起冠状动脉完全或不完全闭塞。VP是指所有那些不稳定和有血栓形成倾向的动脉粥样硬化斑块,它具有以下三大病理特征：①薄的纤维帽。②较大的脂核。③较多的巨噬细胞浸润。研究发现,炎症在VP的形成、ACS发生中发挥重要作用,炎性细胞及其分泌的促炎性细胞因子使动脉粥样硬化斑块的纤维帽变薄、脂核增大,致VP的表型的形成,因VP易于破裂而引起ACS的发生。参与VP形成的促炎性细胞因子较多,传统的促炎性细胞因子主要包括C反应蛋白、白介素-6、白介素-1、肿瘤坏死因子等。最近,越来越多学者关注新近发现的炎性细胞因子与VP的关系,其中以白介素-18(interleukin-18, IL-18)最具代表性。IL-18是在炎症反应中发挥关键性作用的多效能促炎性介质,它主要由巨噬细胞系统如单核-巨噬细胞、肝脏Kuffer细胞等产生。人IL-18基因上存在多个多态性位点,启动子区-607C/A、-137G/C是研究得最多的多态性位点,也是调控IL-18表达的重要位点。研究发现,IL-18基因启动子区-607C/A、-137G/C与CHD的发生发展密切相关。研究证实,IL-18不仅参与了冠状动脉动脉粥样硬化的发生,而且可增加动脉粥样硬化斑块的不稳定性,使其成为引起ACS发生的重要病理生理因素-VP。IL-18能通过调节CXCL16和以MMP9依赖的方式诱导冠状动脉平滑肌细胞迁移,加速动脉粥样硬化的进展,加重血管的狭窄；IL-18还可诱导血管内皮细胞产生肿瘤坏死因子-α、白介素-1、Fas配体及粘附分子等生物活性物质,调控动脉粥样硬化斑块内单核-巨噬细胞沉积及诱导细胞死亡,而两者均是引起VP形成的重要机制,也是动脉粥样硬化斑块破裂和血栓形成的关键因素,而冠状动脉内动脉粥样硬化斑块破裂、血栓形成则是ACS发生的主要病理生理过程。由此可见,IL-18可能在VP的形成发展中发挥重要作用,但相关的研究不多,且大多数研究只从神经-体液、细胞的水平上揭示了IL-18参与动脉粥样硬化斑块及VP的发生发展。最近,在基因的水平上已有新的进展,国外有研究表明,IL-18基因启动子区-607C/A、-137G/C多态性与CHD的发生发展密切相关,从基因的水平上揭示IL-18参与冠状动脉动脉粥样硬化斑块的发生,然而,目前尚无在基因的水平上证实IL-18参与VP形成的相关研究。本研究观察IL-18基因启动子区-137G/C、-607C/A的基因多态性及其水平与VP的关系,从基因和蛋白质的水平上明确IL-18与VP的相关性,以探索IL-18在VP形成中的可能作用,也有助于研制针对不同炎症靶向途径的药物以抑制动脉粥样硬化的发生及降低其转化为VP的风险。综上所述,IL-18不但在促进动脉粥样硬化斑块发生中发挥不可忽略的作用,而且在VP的形成中也扮演十分重要的角色。但目前,IL-18在VP发生发展中的机制尚不完全清楚。研究表明,IL-18可诱导多种细胞发生凋亡,而动脉粥样硬化斑块内细胞凋亡是VP的重要特征之一,斑块内的凋亡细胞增多可以促进动脉粥样硬化斑块的坏死核心增大、纤维帽变薄、炎症反应增强,可见,IL-18诱导斑块内细胞凋亡可能是VP形成的重要环节,但相关的研究缺乏,尚需进一步研究以明确其在VP形成中的角色及其机制。本研究采用不同IL-18刺激浓度及刺激时间,对离体动脉粥样硬化斑块进行刺激,观察被刺激后斑块内的细胞凋亡指数及斑块的形态变化,以证实IL-18通过诱导动脉粥样硬化斑块内细胞凋亡是其促进VP的形成的机制之一,不仅丰富了VP形成的机制学说,还为VP的防治提供新思路及理论依据。第一章 白介素-18与冠状动脉易损斑块的关系研究目的1.通过检测不同类型CHD患者IL-18基因启动子区-607C/A、-137G/C的多态性及其血浆IL-18的水平,探讨IL-18在冠状动脉粥样硬化发生、发展中的可能作用。2.观察不同冠状动脉斑块类型的CHD患者IL-18基因启动子区-607C/A.-137G/C的多态性及其血浆IL-18的水平,了解IL-18与冠状动脉VP的关系,探索IL-18促进冠状动脉VP形成、发展中的可能机制。3.对215例稳定型心绞痛(stable angina pectoris, SAP)患者进行2年随访,观察SAP患者发生ACS前后血浆IL-18水平的变化,探讨IL-18在ACS发病机制中的可能作用及临床价值。对象与方法对象选自2007年3月至2011年3月收住广州军区总医院心血管内科首次行冠状动脉造影术(coronary angiography, CAG)和(或)接受冠状动脉血管内超声(intravascular ultrasound, IVUS)检查的患者,排除合并心肌炎、心肌病、严重心功能不全、周围血管疾病、脑卒中、肝肾疾病、自身免疫性疾病、血液病、炎症感染、恶性肿瘤、发热、心脏瓣膜病、严重的全身其他系统疾病、近期创伤或手术、近4周口服抗凝药以及目前正在使用炎性抑制物的患者,研究对象623例。方法根据患者CAG的结果将研究对象分为正常对照组(173例)和CHD组(450例),结合其临床表现把CHD组患者分为稳定型心绞痛(stable angina pectoris,SAP)(236例)组、ACS组(214例)或急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)组(101例)、不稳定型心绞痛(unstable angina pectoris, UAP)组(113例)、SAP组(236例),把194例CHD患者根据CAG和IVUS的结果分为VP组(116例)和稳定性斑块(stable plaque, SP)组(78例)。对211例SAP患者随访2年后,根据是否发生ACS将其分为发生ACS组(38例)和无ACS组(173例)。采用聚合酶链反应-序列特异性引物(polymerase chain reaction sequence specific primer, PCR-SSP)技术检测目的基因(IL-18基因启动子区-607C/A、-137G/C)单核苷酸的多态性,并以琼脂糖凝胶电泳和DNA测序来验证其准确,采用ELASA法检测研究对象血浆IL-18的水平。使用独立样本t检验比较CHD组患者与正常对照组的年龄、身体质量指数的差异,并分别比较CHD组与正常对照组、ACS组与SAP组、VP组与SP组患者血浆IL-18水平的差异；采用配对样本t检验比较发生ACS的SAP患者在发生ACS前后血浆IL-18水平的差异；四格表的χ2检验比较CHD组与正常对照组的男性百分比、吸烟率、有CHD家族史患者的百分比、糖尿病发生率、高血压病发生率、高脂血症发生率比率的差异,并比较CHD组与正常对照组、ACS组与SAP组、VP组与SP组患者IL-18基因启动子区-607C/A、-137G/C的各个基因型频率及单体基因型频率的差异；使用One-way ANOVA分析不同类型CHD患者、不同IL-18基因启动子区-607C/A、-137G/C基因型的患者血浆IL-18水平的差异,各组间多重比较方差齐的用LSD检验,方差不齐的用Tamban-e’s T2进行检验。P<0.05为差异有显著性意义。结果1.CHD组患者血浆IL-18水平显著高于正常对照组(t=9.118,P=0.000),不同临床类型CHD患者血浆IL-18水平存在显著性差异(F=102.500,P=0.000),其中AMI组患者高于UAP组(P=0.002),UAP组患者高于SAP组(P=0.000),SAP组患者高于对照组(P=0.001), ACS组患者高于SAP组(t=12.353, P=0.000), VP组患者高于SP组(t=3.818,P=0.000)；2.不同IL-18基因启动子区-607C/A位点基因型的患者血浆IL-18水平存在显著性差异(F=9.170,P=0.000),其中CC型的患者血浆IL-18水平显著高于CA型(P=0.020)和AA型的患者(P=0.000),CA型的患者高于AA型(P=0.037)；不同IL-18基因启动子区-137G/C位点基因型的患者血浆IL-18水平存在显著性差异(F=4.377, P=0.013), IL-18基因启动子区-137G/C位点的基因型为GG型的患者血浆IL-18水平显著高于CC型的患者(P=0.006),GC型的患者与GG型及CC型的患者相比,差异无统计学意义(P均>0.05)；3.不同IL-18基因启动子区-607C/A位点的基因型及单体基因型在CHD组和正常对照组间、ACS组和SAP组间、VP组和SP组间的分布频率的差异均有统计学意义(P均<0.05),CC基因型在CHD组患者的分布频率显著高于正常对照组(χ2 =35.545, P=0.000),ACS组患者高于SAP组(χ2=16.244, P=0.000), VP组患者高于SP组(χ2=7.963,P=0.005),-607C单体基因型在CHD组患者的分布频率显著高于正常对照组(χ2=30.392, P=0.000),ACS组患者高于SAP组(X2=20.237, P=0.000), VP组患者高于SP组(χ2=13.677, P=0.005); AA基因型在CHD组的分布频率显著低于正常对照组(χ2=4.426, P=0.035), ACS组患者低于SAP组(χ2=6.878,P=0.009), VP组患者低于SP组(χ2=7.517,P=0.006),-607A单体基因型在CHD组的分布频率显著低于正常对照组(χ2=30.392, P=0.000), ACS组患者低于SAP组(χ2=20.237, P=0.000), VP组患者低于SP组(χ2=13.677,P=0.000); IL-18基因启动子区-607C/A位点CA基因型在CHD组患者的分布频率显著低于正常对照组(χ2=16.670,P=0.000),但在ACS和SAP组间、VP组和SP组间的分布频率无显著性差异(P均>0.05)。不同IL-18基因启动子区-137G/C位点的基因型在CHD组和正常对照组间、ACS组和SAP组间、VP组和SP组间的分布频率均无显著性差异(P均>0.05),IL-18基因启动子区-137G/C位点的G单体基因型在CHD组患者中的分布频率显著高于正常对照组(χ2=4.142,P=0.042),IL-18基因启动子区-137 C单体基因型在CHD组患者的分布频率显著低于正常对照组(χ2==4.142,P=0.042),两者在ACS组和SAP组间、VP组和SP组间的分布频率均无显著性差异(P均>0.05)。4.随访前,发生ACS的SAP患者血浆IL-18水平显著高于无ACS组(t=6.205,P=0.000),发生ACS组患者发生ACS后血浆IL-18水平显著高于ACS发生前(t=11.083,P=0.000)。结论1.不同类型CHD患者血浆IL-18的水平均升高,并且与病情平行,提示IL-18在CHD的发生发展中可能发挥重要作用,且可作为CHD病情评估的参考指标；2.IL-18基因-607C/A和-137G/C位点的基因多态性均可影响血浆IL-18的水平,其中IL-18基因-607C/A位点的基因多态性和血浆IL-18的水平与冠状动脉VP及ACS的发生密切相关,提示IL-18在VP的发生发展中可能发挥重要作用。第二章IL-18诱导动脉粥样硬化斑块内细胞调亡促易损斑块的形成目的1.通过高脂饮食建立兔动脉粥样硬化模型并获得动脉粥样硬化斑块后,采用不同比-18刺激浓度和刺激时间对离体动脉粥样硬化斑块进行刺激,观察被IL-18刺激后斑块的形态及斑块内细胞调亡情况的变化,探索IL-18在促进VP形成中的可能机制。2.了解动脉粥样硬化斑块内细胞的调亡指数与斑块帽/核比值的关系,探讨斑块内细胞调亡在VP形成中的可能作用。材料与方法材料30只健康雄性新西兰白兔,均为3月龄,予适应性喂养1周后给予高脂饮食(高脂饲料的配方为:普通兔饲料加1.5%胆固醇粉、0.05%胆盐、5%猪油)10周,10周后,处死并解剖动物,暴露动物的主动脉全长,清除附着于主动脉上的脂肪与组织,根据动脉粥样硬化斑块的分布把腹主动脉切割成若干个血管块,共获得60个血管块。方法通过高脂饮食建立兔动脉粥样硬化模型并获得动脉粥样硬化斑块后。采用IL-18的3种刺激浓度和4种刺激时间对离体动脉粥样硬化斑块进行规激,到达刺激时间后使用甲醒固定标本,常规石蜡包埋、切片、组织HE染色。采用Image-Pro Plus图像分析软件采集分析图像,测量斑块纤维帽的厚度与脂核横截面的平均厚度,并计算帽/核比值,采用TUN化法检测动脉粥样硬化斑块内的细胞调亡情况。使用析因方差分析法分析不同IL-18浓度及时间刺激组斑块的纤维帽厚度、脂核横截面厚度、帽/核比值、斑块内细胞调亡指数的差异,采用Pearson相关分析法分析斑块的帽/核比值与斑块内细胞调亡指数的相关性。结果1.动脉粥样硬化斑块内的细胞调亡指数随IL-18刺激的时间和浓度的改变而变化(F=50.790,P=0.000)。随着IL-18刺激时间的延长、刺激浓度的升高,斑块内的细胞调亡指数有上升趋势,IL-18的刺激时间与刺激浓度间存在交互效应(护31.517,戶=0.000);2.动脉粥样硬化斑块的纤维帽厚度随IL-18刺激的时间和浓度的改变而变化(F=4.437,P=0.000)。随着IL-18刺激时间的延长、刺激浓度的升高,斑块的纤维帽厚度有下降趋势,IL-18的刺激时间与刺激浓度间不存在交互效应(F=1.633,P=0.159);3.动脉粥样硬化斑块的脂核横截面厚度随IL-18刺激的时间和浓度的改变而变化(F=2.209,P=0.046)。随着IL-18刺激时间的延长、刺激浓度的升高,斑块的脂核横截面厚度有上升趋势,IL-18的刺激时间与則激浓度间不存在交互效应(F=0.683,P=0.664);4.动脉粥样硬化斑块的帽/核比值随IL-18刺激的时间和浓度的改变而变化(F=12.467,P=0.000)。随着IL-18刺激时间的延长、刺激浓度的升高,斑块的帽/核比值有下降趋势,IL-18的刺激时间与刺激浓度间存在交互效应(F=4.134,P=0.002);5.经不同刺激浓度和刺激时间正-18刺激盾,动脉粥样硬化斑块内的细胞调亡指数与斑块的帽/核比值呈显著线性负相关(r=-0.776,P=0.000)。结论1.IL-18可促进离体动脉粥样硬化斑块内的细胞发生调亡;2.动脉粥样硬化斑块内的细胞调亡指数与帽/核比值呈显著线性负相关,提示斑块内的调亡细胞是VP形成的重要因素之一。3.IL-18诱导动脉粥样硬化斑块内细胞调亡可能是其促VP形成的重要机制。