泥蚶在哈维氏弧菌感染下载菌量变化及抗性相关指标筛选

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泥蚶(Tegillarca granosa)隶属于软体动物门(Mollusca)、瓣鳃纲(Lamellibranchia)、列齿目(Taxodonta)、蚶科(Arcidae)、泥蚶属(Tegillarca),是我国主要滩涂养殖贝类之一,长期以来深受沿海地区居民青睐。然而近年来,养殖过程中时常出现弧菌病爆发和规模性死亡现象,阻碍了泥蚶养殖产业的可持续发展。这固然与环境恶化、密度增加和管理不善等诸多因素有关,但抗性优良品种的缺乏是造成上述现象的重要原因。因此,通过遗传选育的方式培育抗性泥蚶新品系具有重要的经济价值。然而,目前在水产动物中,以提高抗病力为目的的育种与其他如针对生长(体长、体重)性状的选育相比,进展相对缓慢,造成这种状况的重要原因是抗病性状的界定不够清晰以及测定评价较为困难。因此,对表型、遗传信息进行多层次数据化挖掘,构建整合种质表型、基因型和功能标记等信息的数据库显得尤为迫切。本研究首先通过浸泡感染和注射胁迫两种攻毒方式分析哈维氏弧菌对泥蚶的毒性效应;其次分析了弧菌感染下泥蚶各组织中弧菌载量的变化规律;最后基于不同抗性表型差异的泥蚶家系和泥蚶群体,确定了泥蚶抗性相关指标。研究结果可为泥蚶抗病机制解析及抗病育种开展提供理论依据和数据支撑。本研究的主要结果如下:1、本研究建立了弧菌浓度计数标准曲线,采用哈维氏弧菌浸泡感染和注射胁迫两种攻毒方式对泥蚶进行了急性毒性实验,观察泥蚶在菌液胁迫下的存活情况,分析哈维氏弧菌对泥蚶的半致死浓度。浸泡感染实验结果表明,随着感染水体弧菌升高,泥蚶死亡起始时间和最大日死亡率时间均有所提前,泥蚶死亡情况呈现上升趋势,当浸泡浓度超过2×10~7CFU/m L,泥蚶15 d累计死亡率接近100%。注射胁迫实验结果表明,泥蚶死亡率与弧菌注射浓度呈显著正相关(r=0.964,P<0.01)。Probit回归分析结果显示,哈维氏弧菌浸泡感染泥蚶7 d后停止实验,15 d的半致死浓度(LC50)为1.35×10~7CFU/m L;注射胁迫下的96 h半致死剂量(96h LD50)为2.12×10~7CFU/g,说明哈维氏弧菌对泥蚶有明显的毒害作用。研究结果为泥蚶对哈维氏弧菌耐受性、养殖环境条件要求等提供数据参考,并且为泥蚶弧菌病防治提供了理论基础。2、本研究采用哈维氏弧菌浸泡感染泥蚶的方法,记录攻毒水体和泥蚶组织中的哈维氏弧菌含量的动态变化及相关关系。结果显示,弧菌感染浓度为1×10~7CFU/m L,泥蚶血液中弧菌载量显著高于鳃、闭壳肌、外套膜和肝胰腺,各组织中的弧菌载量呈现先上升,后下降,最后维持较低水平的变化规律。持续感染6 d,泥蚶血液中弧菌载量降至10~2-10~4 CFU/m L,其他组织中弧菌载量降至10~0-10~2CFU/mg。检测不同浓度弧菌(1×10~5,1×10~6,1×10~7,5×10~7 CFU/m L)浸泡感染后泥蚶肝胰腺的弧菌载量变化,结果显示,1 d时各感染组肝胰腺弧菌载量均较对照组显著增加(81.0-667.8倍),且与浸泡水体中弧菌浓度呈显著正相关(Spearman’sρ=0.762,P<0.001),5 d时各侵染组肝胰腺弧菌载量均较1 d明显降低,但仍然高于对照组。研究结果为泥蚶感染弧菌发病过程中,免疫识别及免疫响应机制的研究提供了参考。3、采用哈维氏弧菌浸泡感染泥蚶的方式,通过比较4个抗性家系和4个易感家系免疫相关指标差异,筛选与抗性表型性状显著相关的指标;再利用抗性群体和对照群体来检验所筛选的抗性指标的有效性。通过对不同抗性表型泥蚶在哈维氏弧菌感染下弧菌载量、生理代谢、血细胞功能、生理生化指标和基因表达数据进行测定。独立样本T检验分析结果表明,从家系中筛选出了31个生理生化指标、肝胰腺中34个以及鳃组织中33个基因表达数据在不同抗性表型泥蚶家系间存在差异(P<0.05);再经抗性群体和对照群体验证发现泥蚶血细胞总数、肝胰腺中GPx活性、TG含量、Glu含量和肝胰腺中MT、RIG-I、TLR6、DRD3基因表达数据,共计8个指标,可以作为泥蚶应对哈维氏弧菌感染的抗性候选指标。研究结果为泥蚶弧菌高抗的间接选育提供参考。
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