目的：Zeylenone (Zey)为紫玉盘属植物山椒子(Uvaria griandiflora)中分离得到的多氧取代环己烯类化合物。前期的研究发现其对多种肿瘤细胞具有很强的抑制活性。而对耐药肿瘤细胞的抑制作用与敏感肿瘤细胞基本相同,同时明显增强阿霉素的抗肿瘤活性。体内试验结果显示15mg/kg Zey静脉给药对接种裸鼠的人肺癌A549的抑制率为75%,与阳性药gefitinib活性相当,而毒性低于gefitinib。因此,Zey是值得深入研究的抗肿瘤候选药物。但对Zey抑制肿瘤的分子机制尚不明确。本课题在进一步对多种实体瘤筛选的基础上,选择对Zey较为敏感的人宫颈癌细胞系HeLa和Caski作为研究对象,揭示Zey的抗肿瘤作用及其分子机制,为新药开发奠定基础。方法：1.Zey体外抗肿瘤作用研究体外培养人结肠癌细胞HCT-8,人宫颈癌细胞HeLa和Caski,人肝癌细胞HepG2,人乳腺癌细胞MCF-7和MX-1,人口腔表皮样癌细胞KB,人胃癌细胞BGC823,人前列腺癌细胞DU-145和PC-3共10种肿瘤细胞株和人正常前列腺基质永生化细胞WPMY-1和人正常膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1共2种正常细胞株,采用MTT法检测Zey的增殖抑制作用,并计算出半数抑制浓度IC50 (μM)。以对Zey敏感的人宫颈癌HeLa和Caski细胞为研究对象,首先以不同剂量(0、3.27、6.54、13.08、26.16和52.32 μM；0、1.64、3.27、6.54、13.08和26.16μM)的Zey分别于不同时间(12、24、36、72、96 h)处理HeLa和Caski细胞,测定其抑制肿瘤细胞增殖的时效和量效关系。Zey处理细胞24 h后,光学显微镜观察对细胞凋亡形态的影响；DAPI染色观察对细胞核凋亡形态的影响；克隆原形成试验检测对肿瘤细胞集落形成能力的影响；流式细胞术分析对肿瘤细胞周期分布的影响；明胶酶谱法检测对肿瘤细胞基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)分泌的影响。2. SILAC分析Zey对肿瘤细胞蛋白质组表达变化的影响通过体外培养Zey敏感的人宫颈癌HeLa细胞,应用SILAC培养基进行细胞培养、同位素标记,Zey干预24 h后,提蛋白,电泳,进行质谱检测。应用Gene Ontology、 Cytoscape软件和Western blot、qPCR技术分析和鉴定Zey处理前后人宫颈癌HeLa细胞中蛋白质组以及磷酸化蛋白质组表达的变化。3.Zey诱导肿瘤细胞凋亡作用研究应用透射电镜观察Zey对肿瘤细胞超微结构的影响；采用AO/EB染色检测Zey诱导肿瘤细胞凋亡的程度；应用流式细胞术通过JC-1染色检测Zey对肿瘤细胞线粒体膜电位的影响；应用流式细胞术采用Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒检测Zey诱导肿瘤细胞凋亡的时期和比例；采用TUNEL原位检测凋亡法进一步检测Zey对肿瘤细胞诱导凋亡的比例；应用DCFH-DA荧光探针法检测Zey对肿瘤细胞活性氧产生的影响。4.Zey体外抗肿瘤分子机制研究使用Discovery Studio 3.5软件包中ligand profiler模块,对PharmaDB药效团库中6000余种靶点药效团逐一进行匹配计算,对Zey进行作用靶点分析。应用Western blot技术研究①Zey对内源凋亡通路和外源凋亡通路标志性蛋白表达的影响；②Zey对Bcl-2家族蛋白表达的影响；③Zey对Caspase家族凋亡标志性蛋白表达的影响；④Zey对ERK/MAPK通路激酶磷酸化水平的影响；⑤Zey对PI3K/AKT/mTOR通路激酶磷酸化水平的影响；⑥应用小分子抑制剂确定Zey作用PI3K/AKT/mTOR信号通路及其上游RTKs的关键靶点蛋白。5.Zey体内对人宫颈癌HeLa裸鼠移植瘤药效实验及分子机制研究采用人宫颈癌HeLa细胞裸鼠移植成瘤,再把裸鼠传代2代以上的瘤块,使用套管针接种于裸鼠腋部皮下,建立人宫颈癌裸鼠异体移植瘤模型。分别以7.5mg/kg, 15mg/kg剂量腹腔注射给药,连续14天,观察Zey对人宫颈癌移植瘤模型动物的体重、瘤体积和瘤重的影响,计算抑瘤率和T/C值；采用免疫组化和Western blot检测Zey对肿瘤组织中相关信号通路蛋白表达的影响。结果：1.Zey体外抗肿瘤作用的初步研究体外抗肿瘤实验表明,Zey对10种不同来源的恶性肿瘤细胞均具有明显的抑制活性,其IC50值范围为3.3-25.7μM,其中宫颈癌HeLa和Caski细胞对Zey较为敏感,IC50值分别为4.2和3.3μM,而对2种正常细胞WPMY1和SV-HUC-1的抑制作用显著低于肿瘤细胞,IC50值分别为81.4和98.4μM,表明其对肿瘤细胞具有很好的选择性。时效、量效实验表明Zey对HeLa和Caski细胞的抑制作用具有很好的时间-剂量依赖性。Zey干预24 h后,HeLa和Caski细胞皱缩,透光度增加,贴壁能力下降；DAPI染色可以观察到染色质固缩、细胞核碎裂、核解体等现象；克隆实验显示Zey对HeLa和Caski细胞具有较强的集落形成抑制能力；流式细胞仪检测Zey能够将HeLa和Caski细胞分别阻滞在G0/G1期和S期；明胶酶谱实验检测Zey能够抑制HeLa细胞的基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9的分泌。2. SILAC分析Zey对肿瘤细胞蛋白质组表达变化的影响为了明确Zey抗肿瘤作用的蛋白质组变化,从而能够高效、快速地定位Zey可能的作用靶点和作用机制,应用SILAC蛋白组学技术对Zey作用前后的蛋白质组的变化进行了筛选。结果发现Zey作用HeLa细胞24 h导致229个蛋白显著改变,15个蛋白表达上调,214个蛋白表达下调,其中下调幅度较大的蛋白包括：14-3-3protein theta、14-3-3 protein zeta/delta、Bcl-2、Mcl-1、Bcl-xL、PARP1、HSP70 1A/1B、 HSP 90-beta、HSP70-4、HSP beta-1、HSP105、HSP 90-alpha、RPL38、RPL17、RPS8、 RPL7a和RPL37a等,这些蛋白主要与细胞能量代谢、细胞凋亡和细胞周期相关。3.Zey诱导肿瘤细胞凋亡作用研究在SILAC实验结果的基础上,我们进一步考察Zey是否能够诱导细胞凋亡。通过透射电镜观察、AO/EB染色、TUNEL、JC-1检测线粒体膜电位、Annexin V-FITC双染检测细胞凋亡的时期和比例以及DCFH-DA荧光探针检测活性氧等实验,可观察到Zey干预24 h后,HeLa和Caski细胞表现出明显的凋亡形态,在超微结构下,能够观察到凋亡小体的产生,线粒体膜电位显著降低,产生大量活性氧,HeLa和Caski细胞凋亡比例最高可分别达到：83.68%和88.00%,表明Zey可明显诱导HeLa和Caski细胞的凋亡。4.Zey体外抗肿瘤分子机制研究对Zey抗肿瘤分子机制的研究发现其明显诱导肿瘤细胞凋亡,对凋亡的内源性通路和外源性通路均产生影响,可活化凋亡因子caspase-8, caspase-9, caspase-7, caspase-3以及PARP和Bid,而使FasL、Bcl-2、Bcl-xL等表达下降,FasL、Fas、FADD等表达上调,诱导线粒体内Cytochrome c和AIF释放到胞质。应用Discovery Studio 3.5中的PharmaDB药效团库寻找Zey潜在的靶标,发现MAPK14是其中一个值得重点关注的靶点,提示Zey的抗肿瘤作用可能与MAPK信号通路有关。ERK/MAPK信号通路是将胞外信号传递到细胞核内最重要的信号通路之一,在调控细胞存活、增殖、分化、凋亡、代谢等功能中具有关键的作用。Western blot实验结果显示,Zey能够抑制ERK/MAPK信号通路中ERK蛋白的磷酸化,而对上游的MEK、RAF蛋白的磷酸化没有抑制作用。大量研究表明,细胞中另一具有同样关键调控作用的PI3K/AKT/mTOR信号通路和ERK/MAPK信号通路之间存在复杂的串话现象,而通常情况下,PI3K通路正向调节ERK/MAPK通路,也即ERK常通过PI3K通路被活化。因此我们提出假说：Zey对ERK蛋白磷酸化的抑制作用可能是通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的活化来实现的。Western blot实验结果表明,Zey确实能够抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路中PI3K、AKT、mTOR蛋白的磷酸化水平。采用PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂进一步研究PI3K/AKT/mTOR信号通路在Zey抗肿瘤分子机制中的作用：①应用EGFR的抑制剂OSI-744干扰Zey作用后,只对EGFR蛋白的活性产生改变,对PI3K/AKT/mTOR信号通路上、下游蛋白和ERK蛋白的活性没有产生改变；②应用PI3K的抑制剂LY294002干扰Zey作用后,能够干预Zey对EGFR、PI3K、AKT、mTOR以及ERK蛋白磷酸化的抑制作用,并且还对凋亡相关蛋白Bax、Bad、Bcl-2和caspase-3的活化产生影响；③应用AKT的抑制剂MK-2206、mTOR的抑制剂Rapamycin干扰Zey作用后,均没有明显对PI3K/AKT/mTOR信号通路上、下游蛋白以及ERK蛋白的活性产生改变。这些结果说明,Zey可能是通过抑制PI3K活性来抑制肿瘤细胞的增殖和诱导凋亡的。5.Zey体内对人宫颈癌HeLa裸鼠移植瘤药效实验及分子机制研究体内实验结果显示,15 mg/kg Zey对人宫颈癌HeLa裸鼠异体移植瘤的抑制率为83%,与阳性药紫杉醇(15 mg/kg)活性相当,而且对裸鼠体重没有明显影响。此外,Zey明显减少肿瘤组织中p-PI3K蛋白的表达,与体外实验结果一致。进一步证明了Zey的作用靶点可能是PI3K蛋白。结论：1.Zey对多种肿瘤细胞具有显著的抑制活性,其中宫颈癌细胞较敏感。且对正常细胞和肿瘤细胞具有很好的选择性。2.Zey能够时间、剂量依赖地抑制宫颈癌细胞增殖、克隆形成及细胞侵袭能力。3.Zey能够剂量依赖地抑制人宫颈癌HeLa裸鼠异体移植瘤的生长,与紫杉醇活性相当。4.Zey可引起细胞周期阻滞,诱导细胞凋亡,并对细胞凋亡的内、外源通路均产生影响。5.Zey的抗肿瘤作用与细胞能量代谢、细胞凋亡和细胞周期相关的蛋白有关。并主要通过调节Bcl-2家族蛋白和影响PI3BK/AKT/mTOR, ERK/MAPK信号通路而起到抗肿瘤作用。6.小分子抑制剂实验表明Zey作用机制之一可能是通过作用于PI3K蛋白而抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡。7.Zey有可能作为PI3K的抑制剂,值得更深入的研究。