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蛛丝蛋白纤维作为一种优异的生物学材料,在生物医学工程领域具有极大的潜在应用价值,已有研究表明,重组蛛丝蛋白可用作血管、神经导管及药物载体等。目前重组蛛丝蛋白的研究主要集中于牵引丝、次壶腹腺丝及鞭毛状腺丝蛋白质。缺少梨状腺丝蛋白(Pyriform Spidroin,PySp)的研究,尤其是大腹园蛛(A.ventricosus)梨状腺丝蛋白的编码序列至今仍未有报道,其生物学功能仍有待研究。为了解析大腹园蛛梨状腺丝蛋白重复区(Rp)的功能、研究C端非重复区(CT)对成丝机理的影响、测试梨状腺丝素蛋白的力学性能、获得一种材料学性能优良的重组蛛丝蛋白、为蛛丝蛋白的仿生提供理论依据,本课题开展了以下几个方面的研究工作并都取得了较理想的研究结果。(1)以本实验室前期构建的大腹园蛛基因组为模板,设计特异性引物,克隆获得一段蛛丝蛋白编码序列,通过Blast比对分析,确定该序列包含大腹园蛛梨状腺丝(Piriform spidroin,PySp)的一段完整重复区(Rp)的编码序列,该序列为A.ventricosus的首条完整的PySp重复区基因序列,填补了国内A.ventricosus丝蛋白编码基因克隆的空白,为丝蛋白基因的研究增填了新成员。(2)将PySp-Rp模块与MiSp-NT/CT模块重组构建不具有CT功能模块的MiSpNT-PySp Rp与具有完整功能模块的MiSpNT-PySp Rp-MiSpCT重组蛛丝蛋白表达载体,进行蛋白质表达和纯化,并且优化两种蛋白的表达产量。经过SDS-PAGE胶和Western-blot鉴定,两种重组蛛丝蛋白均能在大肠杆菌中表达,表达产量较高,形成包涵体,经过变性纯化,获得了纯度较高的重组蛛丝蛋白。(3)采用圆二色谱(Circular dichroism,CD)测定不同pH下两种重组蛛丝蛋白溶液的二级结构,计算各二级结构百分含量的变化;使用傅里叶红外光谱(ATR-FTIR)测定两种重组蛛丝蛋白冻干后的红外光谱,计算其酰胺Ⅰ带的各二级结构百分含量。比较两种蛛丝蛋白的二级结构组成发现,随着p H值降低,CT结构域会引发PySp二聚化促进其成丝;红外光谱显示,CT结构域会增加PySp纤维的β折叠的百分含量,揭示了C端非重复区的存在可促进丝素蛋白质的组装成丝,有利于提高固着丝纤维机械性能。(4)使用扫描电镜(Scanning electron microscope,SEM)观察湿纺获得的MiSpNT-PySpRp-MiSpCT重组蛛丝蛋白纤维的表面形态,显示湿纺形成的MiSpNT-PySpRp-MiSpCT重组蛛丝蛋白纤维表面整体光滑,直径整体均匀,类似于天然蛛丝纤维形态,直径较天然蛛丝略粗,大约为20 um左右。综上所述,本课题不仅填补了大腹园蛛梨状腺丝蛋白重复区编码基因的空白,同时以该基因为基础,进一步深入研究了CT对蛛丝蛋白成丝机理的作用机制,后续还需要通过增加剪切力等条件进一步探索该重组蛛丝纤维的力学性能。本研究为今后重组蛛丝蛋白的仿生提供了新的理论基础。