免疫性疾病及免疫相关性损伤是一类极为常见的临床病症，涉及人体多个脏器、组织，因该类疾病具有发生率较高、临床经过复杂、发病机制不明、治疗靶向性差、长期预后不佳等特点，目前已成为临床研究、探索的重点。 原发性肾病综合征(INS)正是这样一类主要由免疫性机制所致损伤的疾病。由于对其病因、发病机制缺乏本质的了解，过去几十年的工作均主要集中在对免疫系统异常的探究及寻找各种免疫抑制剂、阻断剂去中止异常发生的免疫反应。到目前为止，。肾小球肾炎的治疗并无突破性进展。 晚近的神经．内分泌．免疫调节学研究表明，机体的免疫活动及其功能状态直接受神经、内分泌系统的调控；机体免疫内环境的稳定不仅依赖于免疫系统的自身调节，更取决于神经、内分泌系统的平衡、维持。这一理论的奠定，促使我们跳出旧有的、局限于免疫系统的研究模式，从神经、内分泌、免疫调节这一整体的角度去研究肾小球肾炎的发生。 神经内分泌免疫网络十分复杂，下丘脑-垂体-肾上腺-免疫轴是其中一条重要的调节环路。其中糖皮质激素(GC)作为该轴的关键分子，对免疫机能可产生全面的抑制性调节作用。半个世纪以前，人们便已注意到GC的作用，自从1940年Baldwing首先使用GC治疗肾小球肾炎以来，GC已经使大量原发或继发性肾小球肾炎得到了不同程度的缓解。迄今为止，GC仍然是临床治疗肾小球肾炎及其他免疫性疾病的一线、首选药物。 然而，临床上并非所有肾炎患者使用GC均能收到满意疗效，一部分患者表现出对GC明显低反应，无反应性的临床表征，从而导致治疗无效，临床上称之为GC抵抗。众所周知，GC的疗效完全取决于患者对它的反应性。事实上，目前临床已有较多发现与GC抵抗现象相关。在慢性疲劳综合征、类风湿性关节炎、过敏性紫癜等免疫性疾病的患者体内可以见到对内源性GC反应性降低，而部分这类患者在治疗过程中也可以见到GC的抵抗现象。同时有研究显示正常人群GC反应的敏感性也存在着相当的差异，说明正常人群中本身即存在一定比率的对GC抵抗的个体，推测GC抵抗者的遗传背景可能与GC敏感者不同，容易罹患各种免疫损伤性疾病，并且在疾病治疗中很可能发生GC抵抗。上述研究提示GC抵抗更像是一种独立的病，且其发生率比预期的高许多。 为此，我们提出假设：GC抵抗是一种神经．内分泌．免疫内环境失衡的重要病理生理现象。GC抵抗可能一方面导致机体对内源性(分泌性)GC的神经．内分泌-免疫调节作用低反应，无反应，参与、诱导免疫损伤性肾炎的发生、发展；另一方面，GC抵抗可直接影响患者对外源性(药物性)GC的治疗反应及副作用的产生，影响患者的治疗及预后。在后基因时代的今天，个体化医疗已成为临床医学发展的必然趋势，我们探究GC抵抗的机制及GC抵抗与免疫损伤性肾炎发生之间的可能联系对揭示免疫损伤性疾病的本质、指导更为科学、合理、有效的治疗具有重要的意义。 GC抵抗的发生是一个复杂的病理生理过程，GC效应的发挥主要是通过糖皮质激素受体(GR)实现的。GR正常构象的形成、激活、功能发挥与其分子伴侣一热休克蛋白90(HSP90)关系密切，因此： 目的：拟通过系列研究，探讨GC抵抗中HSP90和GR的分子作用机制。 1、研究HSP90在淋巴细胞株GC反应性中的作用：体外培养GC敏感、GC抵抗的淋巴细胞株，检测特异阻断HSP90前后细胞株GC反应性的变化。 2、研究不同GC反应性的INS患者HSP90的表达、亚细胞分布及其与GR、GC反应性之间的联系。 3、人为调节PBMC中HSP90的表达和功能，探究此时PBMC GC反应性的变化。 4、进一步研究不同GC反应性的INS患者PBMC细胞核内HSP90与GR之间的相互关系；GR与靶基因/核反应元件的结合活性，来深入探讨GC抵抗患者细胞核内分子机制及HSP90的可能影响作用。 方法： 1、采用流式细胞术和AO/EB免疫荧光双染测定阻断HSP90前后GC敏感、抵抗细胞株GC反应性的变化。 2、采用RT-PCR和激光共聚焦免疫荧光技术检测INS患者PBMC中HSP90和GR表达、亚细胞分布。 3、体外培养正常人PBMC，采用流式细胞术检测DEX诱导PBMC凋亡的时间、剂量模式。 4、用炎性细胞因子IL-6和HSP90特异性阻断剂GA处理PBMC，采用RT-PCR、流式细胞术检测HSP90 mRNA、Pr水平表达，及DEX诱导PBMC凋亡的变化。 5、用DEX诱导GR活化核转位后，采用COIP-WB技术检测INS患者PBMC细胞核内GR、HSP90的相互作用。 6、同时采用EMSA技术检测INS患者GR与靶基因核反应元件的结合活性。 结果： 1、加入GC后，GC敏感细胞株C7H2凋亡可达91.8﹪，而GC抵抗细胞株C1凋亡仅15.2﹪，而加入HSP90特异性阻断剂GA后，GC诱导C7H2凋亡显著减少(18.6﹪vs.98.1﹪，P<0.01)。 2、激素敏感INS患者组、激素抵抗INS患者组与健康对照组比较，GR的表达无明显异常变化(P>0.05)。INS患者HSP90的表达较健康对照组明显增高。并且激素抵抗组INS患者HSP90 mRNA表达显著高于激素敏感组INS患者(P<0.05)。INS患者的HSP90/GR比值明显高于健康对照组(P<0.05)HSP90亚细胞分布研究发现，健康对照组的HSP90主要分布在PBMC的胞浆中，核内含量极微；INS患者增加的HSP90则明显趋向细胞核内分布(P<0.001)。 3、0.01、0.1、1、10 μM DEX处理PBMC都出现了不同程度的凋亡，其中DEX0.1、1 pM处理PBMC凋亡程度都较高，结合文献，选择DEX1 μM处理作为诱导PBMC凋亡的最适浓度；随着时间的延长，在DEX(1μM)处理下，PBMC凋亡百分比不断增高；然而PBMC自然凋亡百分比也在不断增高；在48h的时候，DEX诱导PBMC凋亡显著高于自然凋亡(p<0.05)，因此选择DEX处理48小时作为诱导PBMC凋亡的最适时间。 4、炎症细胞因子IL-6能上调PBMC中HSP90含量，但对DEX诱导PBMC凋亡的影响并不明显。HSP90特异性阻断剂GA是在功能水平阻断HSP90，使得DEX诱导PBMC凋亡会明显减少，表现为GC反应性明显降低。GA能一定程度上上调HSP90表达。 5、用DEX诱导GR活化核转位后，COIP结果显示细胞核中存在着HSP90与GR特异性的相互作用。 6、用DEX诱导GR活化核转位后，GC抵抗INS患者组中，PBMC核内与GR结合的HSP90增多，而GR与细胞DNA上核反应元件结合活性较正常对照组和GC敏感组明显下降。 结论： 1.GC敏感细胞株C7H2对GC诱导凋亡的反应是通过GR介导的，采用GA阻断HSP90功能后，C7H2细胞株的GC反应性显著降低，说明HSP90的阻断可以直接改变C7H2细胞株对GC诱导凋亡的反应，可能参与GC抵抗的产生机制。 2.HSP90的表达及亚细胞分布异常可能在INS发病以及GC抵抗机制的产生中起重要作用。 3.采用炎症细胞因子IL-6和HSP90特异性阻断剂GA调节HSP90含量与功能后，证实了HSP90的功能抑制与GC反应性的关系，但对HSP90表达量异常增高对GC反应性的影响并未得到我们预期的结果，结合我们第二章的发现，我们推测与GC抵抗相关联的不仅仅是HSP90表达量的增加，更重要的可能在于高表达HSP90的异常核内转位及分布，极有可能是核内异常增多的HSP90在GR转入细胞核后的环节上影响GR功能以及GC发挥效应。 4．GR活化转位入细胞核以后，GR与HSP90仍存在相互作用；与正常对照组和GC敏感INS患者组比较，GC抵抗INS患者组PBMC核内与GR结合HSP90增多，干扰了GR与GRE的结合，从而影响GC效应的发挥。