研究背景随着人们生活水平的提高和人口老龄化加速,全球糖尿病发病率日益增长,给全人类的健康安全带来了巨大的威胁。据预测到2025年,中国、印度、美国将成为世界上拥有糖尿病患者最多的国家,糖尿病患病率将达到4.4%,患者数将由2000年的1.71亿人增至2030年的3.66亿人。最近的调查显示,美国每年实施的6万多例非创伤性手术中50%为糖尿病患者；我国三甲医院非创伤性截肢患者中约有1/3为糖尿病所致,我国糖尿病足患者中合并感染率高达70%,糖尿病患者的截肢率是非糖尿病患者的40倍。糖尿病创面愈合延迟的因素众多,包括周围神经病变、免疫反应缺陷、周围微血管病、血红蛋白糖基化引起的组织氧输送不足、红细胞变化、Ⅲ型和Ⅰ型皮肤胶原比例改变[4]、糖尿病皮肤的生物力学改变、成纤维细胞和角质细胞迁移、扩增能力减弱、角质细胞和内皮细胞凋亡等。另外,糖尿病创面愈合延迟与参与组织重建的生长因子不足关系密切,这些生长因子包括PDGF、VEGF、 NOS、KGF和FGF等。与非糖尿病创面相比,在细胞水平上,糖尿病创面中成纤维细胞、角质形成细胞和内皮细胞扩增、迁移能力减弱,上皮细胞凋亡加速,胶原合成减少,血管生成减少和上皮化延迟,正是糖尿病创面的这些缺陷以及并发创面感染和骨髓炎,所以容易导致糖尿病足、甚至截肢。除此之外,干细胞功能受损也会影响创面愈合。在糖尿病大鼠创面模型中,糖尿病创面中分离的表皮干细胞克隆、分化能力降低。但脂肪干细胞与上述细胞不同,糖尿病创面和正常创面中分离的脂肪干细胞可分泌等量的生长因子、细胞因子和Ⅰ型胶原,甚至能以同等速度扩增。因此,糖尿病人的脂肪干细胞可为自身创面愈合和更新提供细胞来源。给非糖尿病大鼠创面局部注射高浓度葡萄糖将抑制血管的正常形成过程,表明高血糖将直接影响血管新生。创面新生血管不足将限制炎症细胞进入创面,同时炎症细胞释放的生长因子也减少,创面的氧气也供给不足。Ferguson等和Delamaire M等在实验中发现糖尿病创面中急性炎症细胞增加,但糖尿病代谢障碍导致中性粒细胞和巨噬细胞迁移能力不足、白细胞趋化能力减弱。因此,细胞水平的变化加大了创面感染、血管形成不足的风险。在分子水平机制上,生长因子通过信号通路调节细胞活性,影响了创面愈合的每个时期。实验证明：生长因子与表皮细胞增殖关系密切,而且可通过调节内皮细胞迁移、增殖促进血管生成。不管在糖尿病动物模型中,还是在Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病病人的临床试验中,糖尿病创面中HIF-1减少,其下游靶基因表达减少或功能减退,如VEGF、PDGF、ANGPT、SDF-1及eNOS等。糖尿病患者下肢皮肤中HIF-1及VEGF的表达降低,导致血管密度下降,血液循环不良和伤口愈合障碍,是糖尿病足发生的重要因素。然而通过慢病毒转染或其它方法维持HIF-1稳定表达,可改善创面微环境,促进新血管生成,加快创面愈合血管再生和血管生成是创面愈合的关键因素。血管不仅仅输送营养物质和氧气到创面,而且携带炎症细胞和干细胞到创面。但是糖尿病创面中微循环受损,其与生长因子、内皮细胞功能受损有关。而血管生成主要由低氧诱导,HIF-1在调节细胞对低氧的反应,创面血管新生中起了至关重要的作用,其中包括内皮细胞活化、迁移和扩增；血管平滑肌细胞迁移和扩增,骨髓源性的成血管细胞动员、分化和扩增以及基质重塑;调节特定的干细胞效应器,控制干细胞迁移及动员、增殖和多向分化。最近研究证实,骨髓来源的内皮祖细胞通过募集、增殖形成新血管是生后血管发生的主要方式。而VEGF和SDF-1是诱导血管发生的重要因子。HIF-1最先是由Semenza和Wang于1992年从低氧诱导肝癌细胞的细胞核提取物中首次发现的。HIF-1是一个异二聚体复合物,由HIF-1α和HIF-1β两个亚基构成。HIF-1β主要在细胞核内持续表达,不受氧浓度影响；HIF-1α在细胞浆内表达,具有氧浓度敏感性。在正氧条件下,HIF-1α不稳定,半衰期小于5min。在低氧条件下,PHDs无活性导致泛素—蛋白酶体作用受到抑制,HIF-1α通过核定位信号(Nuclear localization signal, NLS)介导入细胞核,与目的基因的低氧反应元件(HRE)结合激活靶基因表达,对机体内的一系列因素进行调节。目前研究表明,虽然低氧是调节HIF-1α的主要因素,但还有许多因素影响HIF-1α的稳定性及功能,如血糖浓度、生长因子、细胞因子、活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)、糖基化终末产物(Advanced Glycation End Products, AGEs)及胰岛素等；而且HIF-1直接或间接地调节多种约100多种基因的表达,涉及适应和生存机制,如血管生成、无氧糖酵解、红细胞生成及细胞生长、分化和凋亡。HIF-1最典型的靶基因是VEGF,其它靶基因包括：SDF-1和CXCR4控制EPCs粘附、迁移和归巢,促进新血管生成；NOS促进NO释放,募集骨髓EPCs到血液循环中。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)也称血管渗透因子(vascular permeability factor, VPF),是目前发现的最为强大和专一的刺激内皮细胞增生的因子,除此之外,它还有增加血管通透性,趋化血管内皮细胞等功能[20-221。迄今,已发现了3种VEGF受体(VEGF receptors, VEGFRs): VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3。VEGFR-2主要分布在血管内皮细胞,也分布在造血干细胞、巨噬细胞等。它的主要作用是介导血管内皮细胞增生,趋化内皮细胞和增加血管通透性等功能。因此,VEGFR-2是VEGF的主要功能受体。基质细胞衍生因子-1(Stromal cell derived factor-1, SDF-1,又名CXCL12)最早从啮齿类动物的骨髓中克隆出来,属于CXC类趋化因子。在体内SDF-1的形式主要有两种：分别为SDF-1α和SDF-1β,以SDF-1α为主,SDF-1α在骨髓基质细胞中表达。CXCR4属于CXCR类趋化因子受体,广泛表达在白细胞、CD34+造血干细胞、CD34+祖细胞。一直以来CXCR4被认为是唯一的SDF-1受体,SDF-1与CXCR4特异性结合构成SDF-1/CXCR4生物轴。SDF-1与CXCR4结合后可通过激活多种信号转导通路而介导其生物学行为,如钙流量超载、PI3K-AKT-NF-KB轴系统的活化、MAPK的磷酸化作用。其通过G蛋白依赖的信号转导通路可以激活磷脂酰肌醇-3激酶(P13K),激活后的P13K可以活化多种信号分子,其中最重要的是能够激活PI3K-AKT信号通路。PI3K-AKT信号通路总的效应是抗凋亡和促进细胞的生长与增殖,介导细胞的运动、趋化、黏附等生物学行为。SDF-1/CXCR4与VEGF之间构成了一条旁分泌环路,二者间相互影响,对各自的生物学功能起到加强作用。SDF-1能促进VEGF生成,VEGF上调血管内皮细胞表达CXCR4,从而加强血管内皮细胞对SDF-1的应答。肿瘤的实验研究中证明了SDF-1与VEGF协同作用可促进某些肿瘤新生血管形成。由此可见,在新生血管形成过程中,SDF-1不仅能促进EPCs动员、定向归巢到新生血管部位,同时还能与VEGF协同作用诱导EPCs分化为成熟内皮细胞,形成血管网络结构。PI3K/Akt是一类广泛存在于细胞质中可受细胞因子等激活,主要参与细胞分化和抑制凋亡的信号转导途径。缺氧通过PI3K/Akt信号通道激活核因子κB,其亚基可结合于HIF-1α启动子,导致HIF-la mRNA表达增加。在PKC和PI3K/AKT信号通路中使用化学抑制剂的实验中发现：这两个信号会相互促进,参与保护HIF-1α以免pVHL降解,导致HIFla表达增加。另外,PI3K/Akt对HIF-1α的活性增加作用已在肝细胞瘤细胞[30]、乳腺癌细胞中也得到证实。李丽华等研究发现：神经元缺氧缺血可通过激活PI3K/Akt信号通路,诱导Akt磷酸化,进而促进HIF-1α的蛋白表达,通过维持HIF-1α活性可能治疗新生儿缺氧缺血性脑病。综上所述,创面愈合与低氧环境诱导的HIF-1及其靶基因表达水平及活性关系密切。而目前国内对HIF-1α及下游成血管靶基因在糖尿病皮肤创伤修复过程中的表达及将其用于创面修复的研究并未见报道。本实验自2013年04月至2013年12月以BALB/c正常小鼠创面与糖尿病模型创面为研究对象,观察不同时段创面愈合率,微血管密度,创面组织中Akt、HIF-1α、VEGF、VEGFR2、 SDF-la和CXCR4基因的mRNA和蛋白水平的变化,从血管生成的调控方面阐明糖尿病创面难愈的机制,为临床治疗糖尿病慢性创面提供新的思路。目的研究BALB/c糖尿病小鼠模型创面愈合过程中创面愈合率、微血管表达情况、创面皮肤组织中Akt、HIF-1α、VEGF、VEGFR2、SDF-1α和CXCR4在不同时间点的mRNA和蛋白水平表达情况,从血管生成的调控方面阐明糖尿病创面难愈的机制。方法6周龄BALB/c小鼠60只随机分为对照组和实验组各30只,每天腹腔注射1%链脲佐菌素(40mg/kg,实验组)及等体积柠檬酸缓冲液(对照组0.1mmol/1, PH4.4),连续注射5天,一周后随机血糖值≥16.7mmol/L,视为糖尿病小鼠模型建立成功。造模后4周,建立小鼠背部皮肤正中近颈侧直径约6mm的圆形皮肤全层缺损模型,分别于伤后0、3、7、10天获取创面组织,计算创面愈合率,免疫组化检测CD31表达情况,qRT-PCR和Western Blot检测损伤后各时间点Akt、HIF-1α、VEGF、VEGFR2、SDF-1α和CXCR4的mRNA和蛋白相对表达量。结果在创面愈合过程中,糖尿病小鼠的创面愈合延迟,创面愈合率第3天、第7天、第10天分别为7.0±5.8、38.7±6.0、80.0±3.0(%),明显小于正常小鼠组,有统计学意义(P<0.05)；实验组在创面愈合过程中第三天血管光密度值之间无统计学意义(P>0.05),第7、10天时实验组光密度值小于正常组(0.57±0.10vs0.39±0.09、0.87±0.16vs0.62±0.18),有统计学意义(P<0.05)。糖尿病小鼠皮肤中HIF-1mRNA表达量于创伤后明显增加,第10天时表达量最高,但相对正常小鼠,其表达量总体偏低；糖尿病组VEGF和SDF-1mRNA表达量于创伤后增加,第7天时表达量最高,总体表达水平也较正常小鼠低；Akt、 VEGFR2和CXCR4mRNA表达量于创伤后增加,但表达量低于对照组,有统计学意义(P<0.05)。创伤后糖尿病组和对照组小鼠各种目的蛋白表达明显高于创伤前(P<0.05),基本上是第3、7天表达量达高峰,随之降至创伤前水平；糖尿病小鼠皮肤中HIF-1α、Akt蛋白表达水平低于正常小鼠组,有统计学意义(P<0.05)；创伤后第3天所有目的基因的蛋白水平表达低于正常组(除VEGFR2外)；第7天所有目的基因的蛋白水平表达低于正常组；第10天时VEGF、SDF-1and CXCR4蛋白水平表达低于正常组,有统计学意义(P<0.05)。结论糖尿病小鼠的创面愈合延迟,Akt、HIF-1α、VEGF、VEGFR2、SDF-1α和CXCR4mRNA及蛋白表达水平降低,导致血管形成不足,可能是糖尿病创面愈合延迟的原因之一。