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目的恶性肿瘤细胞对化疗药物产生的多药耐药性（multidrug resistance,MDR）是肿瘤细胞免受化疗药物攻击的最重要的细胞预防机制,是导致化疗失败的主要原因。对于MDR产生机制和逆转剂的研究,目前多采用多药耐药细胞系作体外研究或接种裸鼠体内的研究方法,从某种程度上难以模拟恶性肿瘤细胞在体内受到化疗药物的干预产生的MDR。为克服MDR需寻找有效的逆转剂,目前研究证实多数逆转剂如维拉帕米和环孢素A应用于体内会产生很大的毒性而限制其临床应用;因此开发高效、低毒、价廉的多药耐药逆转剂刻不容缓。盐酸千金藤碱（cepharanthine hydrochloride,CH）具有多种生物学活性,近年国外文献表明其有逆转肿瘤多药耐药的作用。本课题组应用临床治疗肝癌联合化疗FAP方案及采用细胞和分子生物学的检测方法,建立获得性KM小鼠腹水型肝癌（Hca/FAP）MDR体内模型且深入探讨产生的分子机制;同时进一步研究CH对KM小鼠腹水型Hca/FAP模型的逆转作用及机制,为CH将用于临床肝癌耐药的逆转提供科学依据。方法实验采用临床治疗肝癌的联合化疗FAP方案（5-氟脲嘧啶+多柔比星+顺铂）,按浓度梯度递增法诱导KM小鼠肝癌Hca,建立获得性Hca/FAP MDR模型。采用MTT法检测Hca/FAP瘤细胞对7种化疗药物的耐药谱及耐药倍数;应用流式细胞术检测Hca、Hca/FAP瘤细胞对罗丹明123（Rhodamine123,Rh123）蓄积与泵出作用;使用RT-PCR技术检测Hca、Hca/FAP瘤细胞多药耐药基因（mdr1）、多药耐药相关蛋白基因（mrp1）mRNA的表达水平及撤药后Hca/FAP瘤细胞mdr1、mrp1 mRNA的表达考察模型稳定性。进一步研究CH对Hca/FAP瘤细胞多药耐药性的逆转作用。采用流式细胞仪检测CH对Hca/FAP瘤细胞Rh123蓄积与泵出的影响;应用CH联合FAP化疗方案治疗Hca/FAP MDR小鼠,计算生命延长率评价其疗效、流式细胞术PI染色检测对凋亡的影响、RT-PCR技术检测mdr1、mrp1 mRNA表达水平是否改变。通过上述实验阐明Hca/FAP MDR产生机制及CH逆转Hca/FAP MDR的作用和机制。结果1.MTT法检测Hca/FAP瘤细胞耐药谱及耐药倍数Hca/FAP瘤细胞对诱导耐药的FAP化疗方案三种药物即多柔比星（Adriamycin,ADR）、顺铂（Cisplatin,CDDP）、5-氟脲嘧啶（5-Flurouracil,5-Fu）耐药倍数较高,分别为21.45、19.80、8.15倍;且对柔红霉素（Daunomycin,DNR）、依托泊苷（Etoposide,VP-16）、丝裂霉素（Mitomycin,MMC）、长春新碱（Vincristine,VCR）亦有一定程度的耐药性,耐药倍数分别为3.83、2.85、3.48、1.60倍;试验药物对Hca、Hca/FAP瘤细胞的IC50两者相比经统计差异有显著性（P＜0.05）。试验结果表明其对蒽环类抗生素、长春花碱类、鬼臼乙叉甙、MMC和铂类抗肿瘤药物有交叉耐药性;表明小鼠肝癌Hca具有多药耐药表型。2.流式细胞术检测Hca、Hca/FAP瘤细胞对Rh123蓄积与泵出作用Rh123的蓄积试验:Hca瘤细胞平均荧光强度（mean of fluorescence intensity,MFI）为204.3±11.2;Hca/FAP瘤细胞MFI为158.5±6.7,直方图明显左移,MFI值比Hca瘤细胞显著减少,两者间统计学有显著性差异（P＜0.01）;Rh123的泵出试验:Hca/FAP瘤细胞泵出率为68.2±0.6%,而Hca瘤细胞泵出率为37.2±0.5%,药物外排显著增加,直方图显著左移且低平,两者相比经统计有显著性差异（P＜0.01）;Rh123蓄积与泵出试验表明Hca/FAP瘤细胞多药耐药性产生机制之一是通过影响P-糖蛋白的功能,使细胞内药物蓄积减少,泵出加快。3.RT-PCR检测Hca、Hca/FAP mdr1、mrp1 mRNA的表达水平Hca/FAP瘤细胞mdr1、mrp1 mRNA电泳图灰度比值分别为0.4192±0.0468、0.7882±0.3171与Hca瘤细胞的灰度比值0.0480±0.0076、0.1953±0.0568相比,mdr1mRNA表达显著增加,统计学有显著性差异（P＜0.01）;且mrp1表达明显增加,经统计有明显差异（P＜0.05）;说明Hca/FAP多药耐药模型诱导成功,产生机制可能与mdr1、mrp1 mRNA过度表达有关。4.RT-PCR法考察Hca/FAP多药耐药模型稳定性Hca/FAP瘤细胞0周、4周、8周的mdr1 mRNA电泳图灰度比值为0.6874±0.0427、0.5615±0.0837、0.4097±0.0841;mrp1 mRNA电泳图灰度比值为1.1276±0.3256、0.7639±0.1612、0.1232±0.0253;统计学结果显示撤药4周Hca/FAP瘤细胞mdr1、mrp1mRNA表达与0周相比P＞0.05,无统计学差异;而撤药8周mdr1、mrp1mRNA表达与0周相比P＜0.01,统计学有显著性差异;说明撤药4周Hca/FAP瘤细胞多药耐药性保持较稳定,而撤药8周多药耐药性逐渐降低。5.流式细胞仪检测CH对Hca/FAP瘤细胞Rh123蓄积与泵出的影响Rh123蓄积试验:维拉帕米（Verapamil,VER）4μmol·L-1、CH 8μmol·L-1、4μmol·L-1、2μmol·L-1于各检测点与对照组MFI相比均能增加Hca/FAP瘤细胞对Rh123的蓄积,统计学有显著性差异（P＜0.01）。其中CH 8μmol·L-1、4μmol·L-1与VER 4μmol·L-1相比统计学有显著性差异（P＜0.01）;结果表明CH、VER均能增加药物在Hca/FAP瘤细胞内的蓄积,CH 8μmol·L-1、4μmol·L-1作用优于VER4μmol·L-1。Rh123泵出试验:CH 8μmol·L-1、4μmol·L-1于各检测点与对照组MFI相比统计学有显著性差异（P＜0.01）;而VER4μmol·L-1和CH 2μmol·L-1在60min、120min时,与对照组相比经统计有显著性差异（P＜0.01）;CH 8μmol·L-1与VER4μmol·L-1相比无统计学差异（P＞0.05）;结果表明CH能减少Hca/FAP瘤细胞对Rh123的泵出,增加细胞内药物浓度;其中CH 8μmol·L-1与VER 4μmol·L-1相比起效时间早,但作用相当;6.计算生命延长率评价CH联合FAP化疗方案对Hca/FAP MDR模型的逆转作用VER、CH联合FAP化疗方案对Hca/FAP瘤细胞有一定的抑制作用:FAP+VER 2.5mg·kg-1、CH 5mg·kg-1、CH 2.5mg·kg-1组均可明显延长Hca/FAP MDR小鼠的生存时间,生存天数为26.38±7.31、26.44±9.37、27.25±8.53,生命延长率达到了45.18%、45.51%、49.97%,与生理盐水（NS）组（18.17±5.42天）相比有统计学意义（P＜0.05）,三组之间无统计学差异（P＞0.05）;单用FAP、CH 5mg·kg-1、2.5mg·kg-1组与NS组相比无统计学差异（P＞0.05）;表明VER、CH联合FAP化疗方案可延长Hca/FAP MDR小鼠的生存时间,CH与VER的作用相当。7.RT-PCR技术检测CH联合FAP化疗方案对Hca/FAP瘤细胞mdr1、mrp1 mRNA表达水平的影响FAP联合VER 2.5mg·kg-1、CH 5mg·kg-1、2.5mg·kg-1均可明显降低Hca/FAP瘤细胞mdr1mRNA的表达,电泳图灰度比值分别为0.4093±0.1570、0.3733±0.2317、0.4318±0.5324,与NS组（0.7835±0.3027）相比经统计有明显差异（P＜0.05）,而三组之间无统计学差异（P＞0.05）;单用FAP、CH 5mg·kg-1、2.5mg·kg-1组mdr1 mRNA的表达水平与NS组相比无统计学差异（P＞0.05）;对mrp1mRNA的表达,用药各组与NS组相比均无统计学差异（P＞0.05）;结果说明VER、CH联合FAP化疗方案可下调mdr1 mRNA的过度表达,而对mrp1 mRNA的表达无明显影响。8.流式细胞术PI染色检测CH联合FAP化疗方案对Hca/FAP瘤细胞凋亡的影响流式细胞术PI染色结果显示,流式细胞直方图上出现了亚G1峰,Hca/FAP瘤细胞的自然凋亡率为3.8%,FAP、CH5mg·kg-1、2.5mg·kg-1组细胞凋亡率分别为6.13±0.56%、4.65±0.90%、3.75±0.75%,与NS组（3.80±0.24%）相比无统计学差异（P＞0.05）,而FAP联合VER2.5mg·kg-1、CH5mg·kg-1、2.5mg·kg-1给药后,细胞凋亡率有不同程度的升高,分别为17.91±2.81%、20.41±1.69%、15.05±1.05%,与NS组相比经统计有明显差异（P＜0.05）;结果表明VER、CH联合FAP化疗方案能诱导Hca/FAP瘤细胞的凋亡;结论1.采用FAP方案对Hca长期诱导致使其产生MDR,Hca/FAP瘤细胞对蒽环类、长春花碱类、鬼臼乙叉甙、MMC和铂类抗肿瘤药物有不同程度的交叉耐药性。2.Hca/FAP耐药性产生机制与mdr1、mrp1 mRNA过度表达和影响P-糖蛋白的功能,使细胞内药物蓄积减少有关。3.Hca/FAP多药耐药模型保持具有药物依赖性。随着停药时间延长,mdr1、mrp1 mRNA表达降低,获得性多药耐药性逐渐消失。4.CH能通过影响P-gp的摄入和泵出功能而增加Hca/FAP瘤细胞内药物浓度,减少药物的外排;且有浓度依赖性,其中CH 8μmol·L-1作用优于VER。5.CH能增强抗肿瘤药物的作用,逆转肿瘤多药耐药性。CH联合FAP化疗方案通过降低mdr1 mRNA的过度表达,诱导Hca/FAP瘤细胞凋亡而增强抗肿瘤作用,延长小鼠的生存时间。