免疫疗法旨在增强机体自然防御能力以消除恶性细胞,是癌症治疗的一项重大突破,有望彻底改变癌症的治疗方法。自2013年肿瘤免疫疗法被《科学》选为年度突破以来,免疫检查点阻断疗法已成为焦点,并且多个PD-1/PD-L1阻断抗体被美国食品和药物管理局（FDA）批准用于临床。然而,肿瘤细胞已经进化出多种机制以逃避免疫监视,例如抗原呈递的缺陷、免疫检查点的上调以及免疫抑制细胞的募集,阻碍了免疫细胞的抗肿瘤免疫反应。最为代表性的例子是PD-L1,其在多种恶性肿瘤中高表达,能够与活化的T细胞上的PD-1结合,使T细胞耗竭,最终实现肿瘤免疫逃逸。阻断PD-1/PD-L1通路可以解除免疫抑制、重新激活T细胞介导的抗肿瘤反应。虽然临床上使用的抗体或基础研究中采用的小干扰RNA（si RNA）等癌症治疗方法可以阻断免疫检查点通路,但是这两种封锁策略都只能暂时阻断PD-1/PD-L1的相互作用。为了更有效地阻止肿瘤免疫逃逸,永久性地破坏PD-1/PD-L1相互作用有希望从源头上解决这一难题。并且越来越多的证据表明,一些肿瘤存在T细胞浸润不足和免疫抑制的肿瘤TME,被称为“冷肿瘤”,这些特征是导致抗PD-1/PD-L1抗体治疗响应率低的关键因素。因此,增强PD-1/PD-L1阻断效果,并进一步联合将“冷”肿瘤微环境重塑为“热”肿瘤微环境的策略,是一种有前景的方案。基于以上考虑,我们设计了选择性激活的CRISPR/Cas9系统来改善目前免疫检查点阻断（ICB）治疗的不足,并研究其肿瘤治疗的效果。本研究的主要研究内容分为以下两个部分:（1）我们开发了一种红光激活的CRISPR/Cas9系统,可以从基因组水平破坏PD-L1,实现对PD-1/PD-L1通路的永久阻断。该系统由光活化自降解聚乙烯亚胺（PEI）衍生物和质粒p CP（表达Cas9蛋白和靶向PD-L1的向导RNA）构建。在红光照射下,这种红光激活的CRISPR/Cas9系统有效地破坏肿瘤细胞的PD-L1基因,并在肿瘤干样细胞中也能观察到PD-L1的敲除。小鼠肿瘤模型结果表明红光激活的CRISPR/Cas9系统显著增加了CD8+T细胞向肿瘤组织的浸润,有效地激活了T细胞介导的抗肿瘤反应,从而清除肿瘤细胞和肿瘤干样细胞。本研究为阻断PD-1/PD-L1通路的免疫检查点疗法提供了一种新策略。（2）我们设计了一种HSP70启动子驱动的CRISPR/Cas9系统F-PC/p HCP,实现对PD-L1基因的永久破坏,并激发多重的抗肿瘤免疫反应来增强肿瘤免疫治疗。该系统由负载Ce6的氟化树枝状大分子（F-PC）和HSP70启动子驱动的CRISPR/Cas9（p HCP）组成。在660 nm激光下,F-PC可以激活p HCP中的HSP70启动子,诱导Cas9蛋白的特异性表达,从基因组水平破坏PD-L1,最终阻止了肿瘤细胞的免疫逃逸。此外,F-PC/p HCP还可诱导肿瘤细胞的免疫原性细胞死亡（ICD）,并对免疫抑制的肿瘤微环境进行重塑。总之,这种HSP70启动子驱动的CRISPR/Cas9系统显示出了强大的抗肿瘤功效。更重要的是,它还刺激了免疫记忆反应,以抑制远端肿瘤的生长和肺转移肿瘤的发生。这种HSP70启动子驱动的CRISPR/Cas9系统为解决ICB治疗响应率低的问题提供了解决方案。