脂质代谢分为合成代谢和分解代谢,肝脏作为脂类代谢过程中非常重要的器官,充当了脂肪代谢过程中的中转站,从而有序的维持着脂肪的分解和合成,当脂质的合成和分解之间的平衡被打乱,则会导致脂类代谢紊乱的发生。脂类物质过多的在肝脏沉积,便会诱发脂肪肝的出现。当脂肪酸和所结合的转运蛋白未能及时转运到其他组织中去,滞留血液中便可以导致动脉粥样硬化的发生。动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是诸多心脑血管疾病的病理学基础,但是由于该病早期临床症状不明显,病情比较隐匿,患者一旦发现多属于疾病的中晚期,并且很难逆转,动脉粥样硬化粥样斑块期会导致局部血管血栓的形成,斑块脱落往往造成栓塞现象,从而引起心脑血管意外的发生。目前临床上尚无针对该病进行治疗的特效药,多应用他汀类药物辅助治疗,为此延缓AS发生的关键在于预防。非酒精性脂肪肝的发生与脂类代谢异常密切相关,有临床报道非酒精性脂肪肝的出现会加快AS的形成,认为腹部与肝脏脂肪组织的沉积会加重AS的产生,并且建议肥胖人群、高脂人群行常规的腹部彩超检测,确诊有非酒精性脂肪肝的患者行颈部彩超检测,从而达到对于AS的早期发现及干预。高脂血症被认为是诱发AS和非酒精性脂肪肝发生的重要危险因素,课题组既往的研究发现安化黑茶可以起到很好的降低高脂饮食大鼠血脂的效果,同时发现安化黑茶可以起到抑制主动脉炎症因子的表达。黑茶中所富含的茶多酚、茶黄素、咖啡碱对于脂类代谢具有调节作用,并且黑茶在渥堆发酵过程中所产生的冠突散囊菌被发现有类他汀的成分。安化黑茶中所富含的黄酮类物质具有很好的抗血凝、促进纤溶系统活性、抑制血小板形成的作用。黑茶由于具有很好的解油腻的效果一直受到西北少数民族的喜爱,并且有调查研究发现酷爱饮用黑茶的少数民族的心脑血管疾病的发病率远低于内地,那么这种现象的出现是否与饮用黑茶有关呢?安化黑茶对于AS、非酒精性脂肪肝是否也可以起到防治作用呢?我们不得而知,所以亟需通过相关的动物实验和分子生物学实验来进一步验证并提供相应的科学依据,以便更好的揭示黑茶的药用价值。本次的实验研究主要分为五个部分。第一部分为探讨载脂蛋白E（apolipoprotein E,APOE）敲除小鼠的基因鉴定方法;第二部分探讨安化黑茶对于动脉粥样硬化的预防作用;第三部分探讨安化黑茶对于动脉粥样硬化的治疗作用;第四部分探讨安化黑茶对于非酒精性脂肪肝的预防作用;第五部分探讨安化黑茶对于非酒精性脂肪肝的治疗作用。目的:探讨安化黑茶防治动脉粥样硬化、非酒精性脂肪肝形成的相关机理,同时研究非酒精性脂肪肝与动脉粥样硬化之间的相关性。方法:（1）将从南京大学生物模式中心所引进的SPF级别APOE^-/-雄性小鼠饲养于湖南中医药大学SPF中心实验室,采用煮沸裂解法获取DNA信息,运用PCR法鉴定基因型。（2）选取8周龄雄性APOE^-/-小鼠50只,随机分为模型组、阿托伐他汀预防组和安化黑茶高、中、低剂量预防组。其中安化黑茶高、中、低剂量预防组分别予以2.16 g.kg^-1.d^-1、1.44 g.kg-¹.d^-1、0.72 g.kg^-1.d^-1剂量灌胃给药,阿托伐他汀预防组予以10 mg.kg^-1.d^-1剂量灌胃干预,模型组予以等剂量生理盐水灌胃干预,以上各组灌胃同时予以高脂饲料喂养,持续干预17周;另选用8周龄相同背景的C57雄性野生小鼠10只作为空白对照组予以普通饲料连续喂养17周,同时予以等剂量生理盐水灌胃干预。实验末各组小鼠摘眼球取血清用于血脂四项和相关炎症因子的指标检测;取小鼠主动脉用于HE染色并计算斑块面积,运用免疫组化检测动脉斑块附近的Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）、MyD88（myeloid differentiation factor88,MyD88）、核因子Kappa B P50（nuclear factor-kappaB,NF-kB P50）、核因子Kappa B P65（nuclear factor-kappaB,NF-kB P65）、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9,MMP-9）、基质金属蛋白酶组织抑制因子1（Tissue inhibitor of matrix metalloprotease-1,TIMP-1）、白细胞介素-1β（interleukin1β,IL-1β）的表达。运用荧光定量PCR（RT-qPCR）方法来检测动脉组织中TLR4、MyD88、NF-kB、IL-β、ATP结合盒转运体A₁（ATP binding cassette transporter A₁,ABCA₁）的基因表达。（3）选取8周龄雄性APOE^-/-小鼠55只,持续西方饮食饲料喂养13周,同时选用8周龄的C57小鼠作为空白对照予以普通饲料喂养13周,13周后随机抽取5只行HE染色,确定造模成功后根据体质量分层,然后随机分为模型组、阿托伐他汀治疗组和安化黑茶高、中、低剂量治疗组。各组APOE^-/-小鼠继续西方饮食饲料喂养,阿托伐他汀治疗组予以10 mg.kg^-1.d^-1药物进行灌胃干预,安化黑茶高、中、低剂量治疗组分别予以2.16 g.kg^-1.d^-1、1.44 g.kg-¹.d^-1、0.72 g.kg^-1.d^-1的剂量灌胃干预,空白组和模型组予以等剂量的生理盐水灌胃干预,以上药物连续干预8周。实验末各组小鼠摘眼球取血清用于血脂四项和相关炎症因子的指标检测;取小鼠主动脉用于HE染色并计算斑块面积,运用免疫组化检测动脉斑块附近的TLR4、MyD88、NF-kB P50、NF-kB P65、MMP-9、TIMP-1的表达。运用RT-qPCR方法来检测动脉组织中TLR4、MyD88、NF-kB、IL-β、ABCA₁的基因表达。（4）选取8周龄雄性APOE^-/-小鼠50只,随机分为模型组、阿托伐他汀预防组和安化黑茶高、中、低剂量预防组。其中安化黑茶高、中、低剂量预防组分别予以2.16 g.kg^-1.d^-1、1.44 g.kg-¹.d^-1、0.72 g.kg^-1.d^-1剂量灌胃给药,阿托伐他汀预防组予以10 mg.kg^-1.d^-1剂量灌胃干预,模型组予以等剂量生理盐水灌胃干预,以上各组灌胃同时予以高脂饲料喂养,持续干预17周;另选用8周龄相同背景的C57雄性野生小鼠10只作为空白对照组予以普通饲料连续喂养17周,同时予以等剂量生理盐水灌胃干预。实验末各组小鼠摘眼球取血清用于血脂四项的指标检测;称取小鼠体质量、肝重、腹部脂肪重量,计算肝指数;对小鼠肝组织进行匀浆用于检测匀浆液中转氨酶及氧化应激指标,取小鼠肝脏用于HE染色。采用羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（hydroxymethyl glutaryl coenzyme A reductase,HMGCR）、核转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPAR-γ）、硬脂酰辅酶A去饱和酶-1（steroyl-coA desaturase-1,SCD-1）三个指标来观察安化黑茶对于脂类合成的相关影响;采用低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor,LDLR）来观察安化黑茶对于脂类物质的摄取影响;采用ABCA1来观察安化黑茶对于脂质输出的相关影响;通过IL-β指标来观察安化黑茶预防性用药对于肝脏炎症状况的影响。（5）选取8周龄雄性APOE^-/-小鼠55只,持续西方饮食饲料喂养13周,同时选用8周龄的C57小鼠作为空白对照予以普通饲料喂养13周,13周后随机抽取5只行HE染色,确定造模成功后根据体质量分层,然后随机分为模型组、阿托伐他汀治疗组和安化黑茶高、中、低剂量治疗组。各组APOE^-/-小鼠继续西方饮食饲料喂养,阿托伐他汀治疗组予以10 mg.kg^-1.d^-1药物进行灌胃干预,安化黑茶高、中、低剂量治疗组分别予以2.16 g.kg^-1.d^-1、1.44 g.kg-¹.d^-1、0.72 g.kg^-1.d^-1的剂量灌胃干预,空白组和模型组予以等剂量的生理盐水灌胃干预,以上药物连续干预8周。实验末称取小鼠体质量、肝重、腹部脂肪重量,计算肝指数;对小鼠肝组织进行匀浆用于检测匀浆液中转氨酶及氧化应激指标,取小鼠肝脏用于HE染色。本次试验选用HMGCR、PPAR-γ、SCD-1三个指标来观察安化黑茶对于脂类合成的相关影响;采用LDLR来观察安化黑茶对于脂类物质的摄取影响;采用ABCA1来观察安化黑茶对于脂质输出的相关影响;通过IL-β指标来观察安化黑茶干预用药对于肝脏炎症状况的影响。结果:（1）运用琼脂糖凝胶电泳实验观察到APOE^-/-小鼠目的条带与预期的目的条带大小相吻合。（2）安化黑茶对于动脉粥样硬化的预防作用结果如下:模型组小鼠血脂四项显著高于空白对照组,模型组小鼠主动脉瓣膜附近肉眼可见瓷白色斑块形成,显微镜下可见大量的胆固醇结晶及泡沫细胞的出现,提示动脉粥样硬化模型制备成功。与空白组相比,模型组小鼠血清中总胆固醇（total cholesterol,TC）、甘油三酯（triglyceride,TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein,LDL）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein,HDL）含量升高（P<0.05）;与模型组相比,阿托伐他汀预防组和黑茶不同剂量预防组的TG、LDL-C含量降低,阿托伐他汀预防组的TC含量下降（P<0.05）;与阿托伐他汀预防组相比,黑茶高、中剂量预防组的TG含量下降、HDL含量升高（P<0.05）。与空白组相比,模型组小鼠血清氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein,OX-LDL）、IL-1β、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor,TNF-α）、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1,MCP-1）、高敏感性C-反应蛋白（high-sensitivity CRP,hs-CRP）含量升高（P<0.05）;与模型组相比,阿托伐他汀预防组和黑茶不同剂量预防组小鼠血清中OX-LDL、IL-1β、TNF-α、MCP-1、hs-CRP含量下降（P<0.05）。免疫组化实验显示模型组小鼠主动脉部位的TLR4、MyD88、MMP-9、NF-kB P50、NF-kB P65表达最强,TIMP-1偏低,阳性表达主要集中于动脉血管内皮细胞斑块所在的部位,黑茶高、中剂量预防组和阿托伐他汀预防组部位的TLR4、MyD88、MMP-9、NF-kB P50、NF-kB P65表达显著低于模型组,而TIMP-1偏高（P<0.05）。RT-qPCR结果显示,与模型组相比,黑茶不同剂量预防组小鼠动脉TLR4、MyD88、NF-kB、IL-β的基因表达都有所降低,ABCA1基因表达升高（P<0.05）;黑茶不同剂量组相比,中剂量预防组的TLR4、MyD88、NF-kB的基因表达最低（P<0.05）。（3）安化黑茶对于动脉粥样硬化的治疗作用结果如下:模型组小鼠血脂四项显著高于空白对照组,模型组小鼠主动脉瓣膜附近肉眼可见瓷白色斑块形成,显微镜下可见大量的胆固醇结晶及泡沫细胞的出现,提示动脉粥样硬化模型制备成功。与空白组相比,模型组小鼠血清中TC、TG、LDL、HDL的含量升高（P<0.05）;与模型组相比,黑茶不同剂量治疗组TG的含量降低（P<0.05）;与阿托伐他汀相比,黑茶高、中剂量治疗组TG的含量下降、HDL的含量升高（P<0.05）。与空白组相比,模型组小鼠血清中OX-LDL、MCP-1、TNF-α、hs-CRP、IL-1β质量浓度升高（P<0.05）;与模型组相比,阿托伐他汀治疗组和黑茶不同剂量治疗组小鼠血清中OX-LDL、MCP-1、TNF-α、hs-CRP、IL-1β的含量下降（P<0.05）。免疫组化实验显示,模型组小鼠主动脉部位的TLR4、MyD88、MMP-9、NF-kB P50、NF-kB P65表达最强,TIMP-1偏低,阳性表达主要集中于动脉血管内皮细胞斑块所在的部位,黑茶高、中剂量治疗组和阿托伐他汀治疗组部位的TLR4、MyD88、MMP-9、NF-kB P50、NF-kB P65表达显著低于模型组,而TIMP-1偏高（P<0.05）。RT-qPCR结果显示,与模型组相比,安化黑茶不同剂量治疗组小鼠动脉TLR4、MyD88、NF-kB、IL-β的基因表达都有所降低（P<0.05）。黑茶不同剂量治疗组相比,其中高、中剂量治疗组的TLR4的基因表达表达最低;高剂量治疗组的MYD88表达最低;黑茶中剂量治疗组的NF-KB、IL-β表达最低（P<0.05）。（4）安化黑茶对于非酒精性脂肪肝的预防作用结果如下:模型组小鼠肝脏肉眼呈现黄色油腻感,显微镜下可见大小不等的空泡形成,提示非酒精性脂肪肝模型制备成功。与空白组相比,模型组小鼠血清中TC、TG、LDL、HDL含量升高（P<0.05）;与模型组相比,阿托伐他汀预防组和黑茶不同剂量预防组TG、LDL-C降低,阿托伐他汀预防组的TC含量下降（P<0.05）;与阿托伐他汀相比,黑茶高、中剂量预防组的TG含量下降、HDL含量升高（P<0.05）。与模型组相比,空白对照组,阿托伐他汀预防组,黑茶高、中、低剂量预防组小鼠的体重、肝重、脾重、腹部脂肪重量降低（P<0.05）;与阿托伐他汀预防组相比,黑茶高、中剂量预防组的体重、肝重、脾重、腹部脂肪重量、肝指数降低（P<0.05）。与空白组相比,模型组小鼠肝脏谷丙转氨酶（alanine aminotransfease,ALT）和谷草转氨酶（aspartate transaminase,AST）活力升高（P<0.05）;与模型组相比,黑茶高、中、低剂量预防组,阿托伐他汀预防组小鼠肝脏ALT、AST活力降低（P<0.05）,其中黑茶中剂量预防组的ALT活力最低（P<0.05）。与空白组相比,模型组小鼠肝脏的超氧化物歧化酶（superoxide Dismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-PX）活力下降,丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量升高（P<0.05）;与模型组相比,黑茶高、中、低剂量预防组小鼠肝脏中SOD、GSH-PX活力上升,MDA含量下降（P<0.05）;与阿托伐他汀预防组相比,黑茶高剂量预防组小鼠的SOD活力升高（P<0.05）。RT-qPCR结果显示,与模型组相比,安化黑茶不同剂量预防组小鼠肝脏HMGCR、SCD-1、PPAR-γ、IL-β的基因表达都有所降低（P<0.05）,ABCA1基因表达升高（P<0.05）,安化黑茶预防组中LDLR的基因表达与模型组无差异（P>0.05）。黑茶不同剂量预防组相比,黑茶中剂量预防组的HMGCR表达最低（P<0.05）,黑茶高、中剂量预防组肝脏SCD-1、PPAR-γ的表达最低（P<0.05）（5）安化黑茶对于非酒精性脂肪肝的治疗作用结果如下:模型组小鼠肝脏肉眼呈现黄色油腻感,显微镜下可见大小不等的空泡形成,提示非酒精性脂肪肝模型制备成功。与空白组相比,模型组小鼠血清中TC、TG、LDL、HDL的含量升高（P<0.05）;与模型组相比,黑茶不同剂量治疗组TG的含量降低（P<0.05）;与阿托伐他汀相比,黑茶高、中剂量治疗组TG的含量下降、HDL的含量升高（P<0.05）。与模型组相比,空白对照组,黑茶高、中剂量治疗组小鼠的体质量、肝重、腹部脂肪重量降低、肝指数降低（P<0.05）,阿托伐他汀组的肝重和肝脏指数下降（P<0.05）;与阿托伐他汀相比,黑茶高、中剂量治疗组的体质量、腹部脂肪组织质量有所降低（P<0.05）,中剂量治疗组的肝指数有所降低（P<0.05）,低剂量治疗组的体质量有所降低（P<0.05）。与空白组相比,模型组小鼠肝脏中ALT、AST活力降低（P<0.05）;与模型组相比,用药组肝脏中ALT和AST活力降低,其中黑茶中剂量治疗组的ALT活力最低,黑茶高剂量治疗组的AST活力最低（P<0.05）;与阿托伐他汀组相比,黑茶高、中剂量治疗组小鼠肝脏中ALT和AST活力降低（P<0.05）。与空白组相比,模型组小鼠肝脏中SOD和GSH-PX活力降低,MDA含量升高（P<0.05）;与模型组相比,药物组肝脏中SOD和GSH-PX活力升高,MDA含量下降,其中黑茶高剂量治疗组的SOD活力最高,黑茶中剂量治疗组的MDA最低,阿托伐他汀治疗组的GSH-PX活力最高（P<0.05）。RT-qPCR结果显示,与模型组相比,安化黑茶不同剂量治疗组小鼠肝脏HMGCR、SCD-1、PPAR-γ、IL-β的基因表达都有所降低（P<0.05）,ABCA1基因表达升高（P<0.05）,安化黑茶治疗组中LDLR的基因表达与模型组无差异（P>0.05）。结论:（1）采用煮沸裂解鼠尾法获取DNA,琼脂糖凝胶电泳方法鉴定DNA是快速准确鉴定小鼠基因类型的理想方法。（2）安化黑茶防治AS形成的机理可能与降脂、抗炎、抗氧化、抑制TLR4/MyD88/NF-kB通路有关,安化黑茶可以通过抑制MMP-9的表达,增强TIMP-1的表达而起到稳斑作用。（3）安化黑茶防治非酒精性脂肪肝形成的机理可能通过抑制HMGCR、SCD-1、PPAR-γ的表达减少脂类物质合成,增加ABCA1的表达促进脂类代谢,同时通过抗炎、抗氧化来减少氧化损伤。（4）非酒精性脂肪肝与动脉粥样硬化的发病呈正相关性。