产Vero毒素大肠埃希氏菌(Verocytotoxin-producing Escherichia coli, VTEC),又称产类志贺氏菌毒素大肠杆菌(Shiga-like toxin-producing Escherichia coli,SLTEC),是指能够产生对Vero细胞和Hela细胞有毒性的VT1、VT2及VT1、VT2变异毒素的一群大肠埃希氏菌。该类菌主要通过食物传播,动物产品有可能是感染人类的主要来源。能引起任何动物的溶血性尿毒综合症(HUS)、出血性结肠炎(HC)和血栓性血小板减少性紫癜(TTP)等严重疾病。目前世界上许多发达国家和一部分发展中国家都发生过VTEC的暴发流行,成为全球性的公共卫生问题。新加坡官方已明确要求,所有对新进口的肉食品必须检测VTEC,因此建立快速准确的诊断方法已成为动物产品检疫的迫切要求。实时荧光PCR技术是一种新型的核酸检测技术,在临床诊断中已经用于细菌、病毒及遗传性疾病的检测,具有极大的应用价值。本研究中依据SYBR GreenⅠ能和双链DNA结合的特性,根据VT1和VT2毒素基因的保守性分别设计一对引物,进行多重荧光PCR反应,从而为出口肉食品检测和临床诊断提供有力的依据。本课题分两部分进行研究。试验一产vero毒素大肠杆菌(VTEC)多重荧光PCR检测方法的建立该研究的目的是通过比较Genbank中已发表的VT基因序列的同源性,设计特异性引物,利用该引物进行PCR扩增,结果只有以VTEC的DNA为模板可以扩增出95bp和108bp的特异条带。利用SYBR GreenⅠ能和双链DNA结合的特性,通过对试验条件的优化,实现了对VTEC的实时荧光PCR检测。试验中能够检出液体样品中的VTEC细菌数量可达10cfu/mL。试验结果表明建立的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR方法的特异性、敏感性、重复性均达到试验设计要求。试验二VTEC多重荧光PCR法在VTEC快速检测中的应用应用试验一建立的方法检测样品,样品来源有两部分,一部分是模拟阳性样品,另一部分是实际采集样品。并且依此来验证该方法在实际检测中的灵敏度和适用性。结果表明,该方法采用6h的增菌培养后,进行荧光PCR检测,能够检测到原始样品中VTEC最低量可以达到10cfu/g,适合于出口肉食品检测和临床快速诊断。