急性移植物抗宿主病（acute graft-versus-host disease,a GVHD）是异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT）后的主要并发症和死亡原因之一。肠道作为主要靶器官之一,累及率高,治疗效果差,预处理阶段对胃肠道屏障的损伤引起炎性“细胞因子风暴”在a GVHD的发生发展中起重要作用。近年来越来越多的免疫细胞亚群被发现在a GVHD的调控中扮演重要角色,免疫细胞的过继输注在a GVHD的治疗中具有极大的临床应用前景。相较外周淋巴器官,肠道固有层富含γδT细胞,研究表明γδT细胞通常是各类炎症性疾病模型中IL-17A的主要来源,在炎症早期快速响应,参与被感染生物的保护性免疫应答。白细胞介素-17A（Interleukin-17A,IL-17A）作为一种炎症因子在炎性疾病的发生发展中扮演了非常重要的角色,近年来越来越多研究表明IL-17A在a GVHD中起保护作用。因此,探索γδT17细胞在肠道a GVHD中的作用有助于明确这群细胞在炎症部位的区域免疫作用。本课题中我们通过小鼠异基因骨髓移植建立了稳定的a GVHD模型,分析了移植后小鼠a GVHD模型中肠道固有层γδT细胞的功能变化,发现其以分泌IL-17A的亚群为主,进一步通过检测移植后a GVHD模型中肠道固有层γδT17细胞数量变化规律探索其与a GVHD的关系;接着建立了γδT17细胞的体外诱导扩增体系,并对该亚群进行了生物学功能鉴定;最后通过γδT17细胞过继输注的a GVHD模型确定其在肠道a GVHD中的保护作用,对γδT17细胞在体内对不同细胞亚群的调控作用及其相关机制进行了深入的探讨。本研究首次探索了a GVHD肠道固有层γδT17细胞的数量变化;建立了高效的γδT17细胞体外诱导体系;通过建立小鼠异基因骨髓移植（allo-bone marrow transplantation,allo-BMT）模型,首次明确了γδT17细胞过继回输对肠道a GVHD的保护作用,并进一步揭示了肠道固有层中γδT17细胞过继回输后通过招募Gr-1+CD11b+MDSCs并增强其免疫抑制功能负向调控a GVHD的作用机制。我们的研究结果为寻找a GVHD的有效防治策略及临床应用提供了重要的理论依据。1小鼠急性移植物抗宿主病模型中γδT17细胞功能及数量的变化研究目的:建立小鼠allo-BMT模型,检测移植后小鼠a GVHD发生时肠道中γδT细胞的功能变化明确a GVHD中的作用亚群,进一步检测γδT17细胞及相关T细胞亚群的数量和比例变化,判断它们与a GVHD的关系,为探索allo-HSCT后a GVHD中γδT17细胞发挥的作用提供线索。方法:通过异基因骨髓移植建立小鼠a GVHD模型,监测a GVHD临床症状,检测移植前后供者细胞嵌合度,各脏器病理切片H＆E染色等方法判断模型是否建立;分离小鼠肠道固有层单个核细胞,建立γδT细胞流式检测方案,利用流式细胞术分选a GVHD小鼠及无病对照组肠道固有层γδT细胞,并进行单细胞q PCR分析,探索其异质性及潜在功能;建立不同轻重程度的小鼠a GVHD模型,利用流式细胞术（flow cytometry,FCM）监测移植后不同时间点（移植后14天、28天）各组模型小鼠肠道γδT17细胞的数量、比例变化,检测相关T细胞亚群的比例变化。结果:BABL/C受鼠接受致死剂量X射线（7.5Gy）的清髓性辐照,无a GVHD组小鼠单纯回输去除T细胞的C57供鼠骨髓单个细胞（T-cell-depleted bonemarrow,TCD-BM）,a GVHD组小鼠回输TCD-BM和供鼠脾脏T细胞,回输不同数量脾脏T细胞量控制a GVHD的严重程度。造模第7天流式检测供者嵌合度提示为完全嵌合,各组小鼠受辐照影响,体重呈现下降趋势,7-10天后逐步恢复,a GVHD组大部分在移植后14天再次出现体重减轻并伴有脱毛、腹泻、弓背、活动减少等a GVHD症状,移植后21天a GVHD症状较明显时检测小鼠各靶器官（肝脏、肠道、皮肤）病理,a GVHD组可见细胞坏死,组织结构破坏,大量炎性细胞浸润。流式分选造模后各组小鼠肠道固有层γδT细胞并进行单细胞q PCR分析,结果显示a GVHD肠道固有层γδT细胞大部分都高表达il17家族相关基因,提示a GVHD肠道固有层γδT细胞以表达IL-17A为主。流式进一步检测分泌IL-17A的γδT（γδT17）细胞在不同轻重程度a GVHD小鼠中的数量及比例变化,重度a GVHD小鼠肠道固有层γδT17细胞比例升高,但数量显著降低;IL-17A的另一重要来源Th17细胞在疾病进展过程中持续升高,但在各组肠道固有层的比例均显著低于γδT17细胞。结论:小鼠异基因骨髓移植后a GVHD可诱导大部分肠道固有层γδT细胞高表达IL-17A,这群细胞是肠道a GVHD中IL-17A的主要来源;小鼠allo-BMT后a GVHD可导致肠道固有层γδT17细胞的减少,其数量变化与a GVHD病情呈负相关,随着疾病加重,γδT17细胞数量逐渐下降。2γδT17细胞的体外诱导及生物学功能研究目的:体外建立γδT17细胞诱导体系,通过RNA-seq检测诱导前后γδT17细胞差异基因表达探索其潜在功能,并对其体外分泌功能、免疫抑制功能、抗肿瘤效应等进行验证。方法:利用多种细胞因子联合诱导建立小鼠γδT17细胞体外诱导扩增体系,对诱导前后γδT17细胞进行RNA测序探索其潜在功能,根据测序结果对γδT17细胞的分泌功能、免疫抑制功能、肿瘤杀伤功能分别进行体外验证。利用流式微球捕获芯片技术（Cytometric Bead Array,CBA）检测γδT17细胞培养上清中多种细胞因子的蛋白水平,探索其分泌功能;利用Transwell板将MDSCs和γδT17细胞分别培养在上下小室中（对照组下室仅含有等量培养基）,24小时后流式计数下室中MDSCs的绝对值检测γδT17细胞对MDSCs迁移的趋化作用;分选诱导前后γδT17与CFSE标记的活化的小鼠脾脏T细胞体外共培养,4天后流式检测小鼠脾脏T细胞增殖率,计算增殖抑制率;将诱导后的γδT17细胞与CFSE标记的小鼠白血病细胞按不同效靶比体外共培养,4小时后经PI染色,利用流式检测肿瘤细胞的凋亡率。结果:我们成功建立了γδT17细胞体外诱导体系,体外获得大量纯化的γδT17细胞。体外诱导的γδT17细胞测序结果显高表达il17a、il22和csf2,KEGG通路富集分析显示大部分显著性富集的通路为肿瘤信号通路、趋化因子信号通路以及细胞因子-细胞因子受体相互作用通路。CBA结果显示诱导后γδT17细胞分泌IL-17A、IL-22、GM-CSF的能力显著上升。MDSCs迁移实验结果显示γδT17细胞能促进MDSCs的迁移能力,T淋巴细胞增殖抑制实验结果显示γδT17细胞与MDSCs共培养后能增强双方的免疫抑制能力;与小鼠B细胞淋巴瘤细胞株A20共培养后检测肿瘤细胞凋亡比例可发现,γδT17细胞显示出明显的肿瘤杀伤作用。结论:我们成功建立了γδT17细胞的体外诱导扩增体系,并对其进行了体外功能性验证。γδT17细胞可提高Gr+CD11b+MDSCs的免疫抑制功能和迁移能力,其本身还具有肿瘤杀伤作用。3过继回输γδT17细胞对小鼠肠道急性移植物抗宿主病的防治作用及机制研究目的:在建立小鼠异基因骨髓移植及a GVHD模型的基础上,向a GVHD小鼠回输γδT17细胞,对处理后a GVHD小鼠的生存、体重、临床症状评分进行评估,鉴定γδT17细胞在小鼠a GVHD中的作用。明确γδT17细胞过继回输后对肠道a GVHD的免疫调控作用及其相关机制。方法:进一步对γδT17细胞进行体内功能性验证,建立小鼠异基因骨髓移植及a GVHD模型,予诱导后γδT17细胞过继回输,观察共输注后a GVHD组小鼠总体生存率、a GVHD症状、体重变化曲线,送检各脏器病理H＆E染色及相关免疫组化观察炎性细胞浸润情况、肠道隐窝细胞增殖情况。利用流式细胞术检测造模后a GVHD早期（第14天）和晚期（第28天）各组小鼠肠道固有层γδT17细胞和Th17细胞的比例变化;造模后第28天检测各组小鼠肠道a GVHD相关T淋巴细胞亚群及MDSCs与其各亚群的比例变化;利用CBA检测各组小鼠肠道组织裂解液中炎症及趋化相关细胞因子浓度;利用IL-17A中和抗体拮抗γδT17细胞分泌的IL-17A,观察中和后小鼠的生存,验证γδT17细胞对a GVHD的保护作用是否仍然存在,明确γδT17来源的IL-17A在a GVHD中的保护作用及机制;利用Gr-1中和抗体阻断MDSCs在肠道固有层的聚集,检测肠道固有层MDSCs的比例,观察中和后小鼠的生存,验证γδT17细胞对a GVHD的保护作用是否仍然存在,明确γδT17细胞在小鼠体内通过招募MDSCs趋化到炎性肠道的固有层发挥免疫抑制功能。结果:移植当天回输γδT17细胞后,共输注组小鼠相比a GVHD小鼠总体生存明显改善,a GVHD症状减轻,临床评分下降。回输CFSE标记的γδT17细胞并在第5天流式检测各器官荧光强度可以发现,γδT17细胞主要归巢到肠道固有层,其次为肝脏,脾脏和外周血中γδT17细胞比例最低。第21天检测各器官病理评分显示γδT17共回输后肠道病理评分有显著改善,肝脏和皮肤则没有明显差异;肠道ki-67免疫组化显示共回输后肠道隐窝干细胞显著增生,隐窝深度增加。共回输γδT17细胞后肠道固有层γδT17细胞比例较单纯a GVHD组显著增加,Th17细胞比例显著下降;a GVHD小鼠肠道固有层中分泌IFN-γ的CD4+T（Th1）细胞和CD8+T（Tc1）细胞比例较无病对照组均上升,而γδT17细胞过继治疗组小鼠中这些亚群的比例较单纯a GVHD组均下降,调节性T（Treg）细胞比例则未见明显差异;a GVHD小鼠肠道固有层中Gr1+CD11b+MDSCs比例较无病对照组显著下降,而共回输小鼠中该亚群比例较单纯a GVHD组显著上升,其中表型为Ly6G-Ly6Chigh（M-MDSCs）和Ly6G+Ly6Clow（G-MDSCs）的两个亚群均上升。肠道组织裂解液CBA结果则显示a GVHD小鼠中炎性细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-6浓度较无病对照组显著上升,G-CSF和GM-CSF浓度下降,而共回输组小鼠中IFN-γ和IL-6浓度较单纯a GVHD组显著下降,G-CSF和GM-CSF浓度上升,TNF-α浓度无明显差异。向γδT17细胞共输注小鼠分别腹腔注射IL-17A和Gr-1中和抗体后,小鼠肠道固有层MDSCs比例显著降低,小鼠生存率下降。结论:我们首次明确了γδT17细胞过继回输可减轻a GVHD,并主要在肠道固有层发挥免疫作用。γδT17细胞过继回输能抑制肠道固有层a GVHD相关T淋巴细胞（Th1、Th17、Tc1）的增殖,降低肠道中促炎性细胞因子IFN-γ和IL-6的生成。我们首次发现γδT17细胞通过分泌IL-17A招募MDSCs趋化到炎性肠道固有层对小鼠a GVHD的区域免疫进行调控。抑制IL-17A或阻断MDSCs的聚集能逆转γδT17细胞的保护作用。