糖尿病肾病（Diabetic nephropathy,DN）作为糖尿病（Diabetes,DM）最常见微血管并发症,目前已成为导致终末期肾病（End-stage renal disease,ESRD）的最主要原因之一。在我国DN已经超过了肾小球肾炎相关慢性肾脏病,成为ESRD的首要病因。目前临床治疗DN多以控制血糖、血压为主,但并不能完全阻止DN进展。因此,深入研究DN发病机制并寻找新的干预手段,对于减缓DN发生发展具有重要意义。中医理论认为,糖尿病肾脏病属于“消渴病-下消”范畴,消渴失治或治之不当,则致气阴两虚,脾肾两虚,日久则致气血阴阳俱虚,肾络瘀结、浊毒内停。临床治疗早期DN以益气养阴疗效较好。传统中医药和民族医药治疗DN在降糖、降压、降低糖尿病血管病并发症方面独具优势,因此,从天然药物中寻找安全有效的糖尿病治疗药物越来越受到关注。灰兜巴又名灰蔸巴、闭口袋,为地蛛科地蛛属卡氏地蛛（Atypus karschi Doenitz）在老茶树根部所筑的巢穴,可有效降低DM患者血糖,预防其并发症DN等作用,是四川峨眉山地区千年来民间世代相传的治疗糖尿病及其并发症的偏方。新近研究表明,线粒体动力学平衡在2型糖尿病（Type 2 diabetes,T2DM）及其血管并发症中起着至关重要作用。持续高糖环境诱发的线粒体氧化应激可触发线粒体过度分裂,导致线粒体动力学失衡。课题组前期研究发现,益气养阴灰兜巴可明显降低DN大鼠蛋白尿,减轻肾脏损伤,并下调肾脏烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate oxidase 4,Nox4）表达水平,而Nox4是线粒体内活性氧簇（Reactive oxygen species,ROS）的主要生成系统。基于此,我们提出假说:灰兜巴通过减轻DN高糖环境所诱发的氧化应激,从而调控线粒体动力学（Mitochondrial dynamics）平衡,减轻足细胞损伤及凋亡,发挥DN保护作用。本课题在前期研究基础上,以益气养阴灰兜巴为载体,开展体内外实验研究,采用激光扫描共聚焦显微镜、透射电子显微镜、流式细胞术、免疫荧光、免疫组化、蛋白免疫印迹（Western Blot）、荧光定量PCR等检测技术,从线粒体动力学平衡新视角出发,探讨灰兜巴减轻足细胞损伤及凋亡从而缓解DN发生发展的分子机制,为灰兜巴治疗DN提供科学依据。第一章 灰兜巴对糖尿病肾病大鼠的治疗作用研究目的:从糖尿病肾脏氧化应激损伤角度探讨灰兜巴减轻DN大鼠足细胞损伤,降低蛋白尿的肾脏保护作用,为民间药灰兜巴治疗DN提供科学实验依据。方法:实验选取5周龄SPF级健康雄性SD大鼠为研究对象,采取右肾切除术,加高脂饮食喂养,加腹腔注射低剂量（35 mg/kg）链脲佐菌素（Streptozocin,STZ）法诱导DN大鼠模型,假手术对照组（Sham operation control group,SC）只进行右肾暴露。将造模成功大鼠分为DN模型组（DN model group,DNM）,二甲双胍组（Metformin group,MET）,HDB 低剂量组（Low-dose of HDB group,HDBL）,HDB 中剂量组（Medium-dose of HDB group,HDBM）,HDB 高剂量组（High-dose of HDB group,HDBH）,灌胃给药法干预6周。动态监测大鼠空腹血糖（Fasting blood glucose,FBG）和体重（Body weight,BW）,分别于药物干预前后进行口服葡萄糖耐量试验（Oral glucose tolerance test,OGTT）,计算时间-血糖曲线下面积（Area under the time-glucose curves,AUC）,并于实验取材后计算肾脏质量指数（Kidney index,KI）。分别于药物干预前后收集大鼠24小时尿液,利用全自动生化分析仪检测DN大鼠尿液微量白蛋白（Microalbumin,mAlb）和尿肌酐（Urine creatinine,Ucr）,并计算mAlb/Ucr;心脏取血,检测肌酐（Serum creatinine,Scr）和尿素氮（Blood urea nitrogen,BUN）。多功能酶标仪检测大鼠肾脏丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量,PASM染色法观察肾组织病理学改变情况,Western Blot法和免疫荧光法检测肾组织Nox4和足细胞功能蛋白Nephrin表达水平,透射电子显微镜法观察肾小球超微结构改变情况,测量并计算肾小球基底膜平均厚度（Mean thickness of glomerular basement membrane,TGBM）。结果:1.血糖动态监测及OGTT分析结果显示,灰兜巴可明显降低DN大鼠FBG和AUC,但HDBL组降血糖和改善空腹葡萄糖耐量效果不如MET、HDBM、HDBH 组明显。2.体重动态监测结果显示,灰兜巴可缓解DN大鼠BW下降情况,降低KI,且HDBH组KI明显低于MET组（P＜0.01）。3.血液、尿液生化指标分析结果显示,灰兜巴可降低DN大鼠mAlb/Ucr、Scr、BUN 水平,且 HDBH 组低于 MET 组（P＜0.01）。4.灰兜巴可降低DN大鼠肾脏MDA水平,且HDBH组低于MET组（P＜0.05）。5.PASM染色结果显示,灰兜巴可减轻DN大鼠肾小球病理改变。6.Western Blot分析结果显示,灰兜巴可下调DN大鼠肾脏Nox4蛋白表达水平,并上调足细胞功能蛋白Nephrin表达水平,且HDBH组Nox4蛋白表达水平低于MET组,而Nephrin蛋白表达水平高于MET组（P＜0.01）。免疫荧光检测结果与上述检测结果相互印证。7.透射电子显微镜观察结果显示,灰兜巴可改善DN大鼠肾小球基底膜增厚和足突融合情况。TGBM测量结果进一步为镜下观察结果提供佐证。结论:益气养阴灰兜巴可降低DN大鼠FBG,降低肾脏氧化应激水平,减轻DN大鼠足细胞损伤,降低蛋白尿,从而发挥DN保护作用。第二章 基于线粒体动力学平衡研究灰兜巴的DN保护作用目的:基于足细胞线粒体动力学平衡新视角,观察灰兜巴对DN动物模型db/db小鼠的肾脏保护作用。方法:实验选取6周龄SPF级健康雄性C57BL/KsJ-db/db小鼠为研究对象,大小鼠维持饲料喂养5周,待自发成模。随机血糖（Random blood glucose,RBG）≥16.7 mmol/L,并出现微量白蛋白尿（尿mAlb/UCr=30～300 mg/g）,判定DN动物模型建立成功。将成模db/db小鼠分为db/db模型组（DNM）,二甲双胍组（MET）,灰兜巴低剂量组（HDBL）和灰兜巴高剂量组（HDBH）,同周龄db/m设立为对照组（NC）,灌胃给药法干预8周。动态监测小鼠FBG和BW,并于取材后计算KI。分别于药物干预前后收集24小时尿液,并于实验结束时,麻醉后摘眼球取血,ELISA法检测mAlb、Ucr、8-羟化脱氧鸟苷（8-hydroxy 2 deoxyguanosine,8-OHdG）和糖化血红蛋白（Glycosylated Hemoglobin,HbAlc）、SCr、BUN水平。Masson染色法观察肾脏组织病理学改变,并采用Image-Pro Plus 6.0对Masson染色进行半定量分析。多功能酶标仪检测小鼠肾组织MDA水平,Western Blot法分析肾脏Nox4、足细胞标志蛋白WT1、功能蛋白Nephrin和损伤标志蛋白Desmin的表达水平,同时检测线粒体融合相关蛋白MFN1、MFN2、OPA1和线粒体分裂相关蛋白Drp1的表达水平,免疫组化法检测肾小球足细胞功能相关蛋白表达情况并进行足细胞计数,透射电子显微镜法观察灰兜巴对DN小鼠肾脏超微结构的影响。结果:1.血糖动态监测及血液HbAlc检测结果显示,灰兜巴可明显降低DN小鼠FBG和HbAlc。2.体重动态监测结果显示,灰兜巴可减缓db/db小鼠BW增长速度;KI计算结果显示,灰兜巴可降低DN小鼠KI,且HDBH组低于MET组（P＜0.05）。3.血液、尿液生化指标分析结果显示,灰兜巴可降低DN小鼠mAlb/Ucr、8-OHdG/Ucr、BUN 和 Sc 水平,且 HDBH 组低于 MET 组（P＜0.01 或 P＜0.05）。4.灰兜巴可降低DN小鼠肾脏MDA水平,且HDBH组低于MET组（P＜0.05）。5.Masson染色结果显示,灰兜巴可减轻DN小鼠肾脏病理改变,降低肾小球Masson染色半定量评分,且HDBH组评分低于MET组（P＜0.05）。6.Western Blot分析结果显示,灰兜巴可下调DN小鼠肾脏Nox4和足细胞损伤标志蛋白Desmin表达水平,上调足细胞标志蛋白WT1和足细胞功能蛋白Nephrin表达水平,且HDBH组Nox4和Desmin蛋白表达水平低于MET组,而Nephrin和WT1蛋白表达水平高于MET组（P＜0.01）。7.免疫组化染色结果与上述Western Blot分析结果相互印证。足细胞计数结果显示,灰兜巴可减轻DN小鼠肾脏足细胞丢失情况,且HDBH组足细胞计数高于MET组（P＜0.05）。8.透射电子显微镜观察结果显示,灰兜巴可改善DN小鼠肾小球基底膜增厚、足突融合、细胞器肿胀及碎片化（fragmented）线粒体增多等情况。9.Western Blot分析结果显示,灰兜巴可上调DN小鼠肾脏线粒体融合相关蛋白MFN1、MFN2,OPA1表达水平,下调线粒体分裂相关蛋白Drp1表达水平,且HDBH组MFN1、MFN2、OPA1蛋白表达水平高于MET组,而Drp1蛋白表达水平低于MET组（P＜0.01）。结论:灰兜巴可有效降低DN小鼠FBG,其降糖效果与阳性对照药二甲双胍比较无明显差异,但其在减轻DN小鼠足细胞氧化应激损伤、降低蛋白尿、促进线粒体动力学平衡方面却显现出更明显作用效果。第三章 灰兜巴含药血清调控线粒体动力学平衡,减轻足细胞损伤分子机制研究目的:观察灰兜巴含药血清对高糖培养足细胞线粒体动力学平衡的影响,深入挖掘灰兜巴减轻足细胞损伤从而延缓DN发生发展的分子机制。方法:选取健康雄性SD大鼠制备含药血清,采用小鼠条件永生性足细胞系（Mouse Podocyte Clone 5,MPC5）进行细胞实验研究。MTT（Thiazolyl Blue）法检测高糖对足细胞活性的影响,以及不同浓度含药血清对足细胞的毒性作用。细胞实验设置正常糖（5.5 mmol/L）对照组（Normal Glucose group,NG）,高糖（30 mmol/L）诱导组（High Glucose group,HG）,二甲双胍含药血清处理组（Metformin-containing serum group,MET）,低剂量灰兜巴含药血清处理组（Low-dose of HDB-containing serum group,LDBL）,高剂量灰兜巴含药血清处理组（High-dose of HDB-containing serum group,HDBH）。流式细胞术检测足细胞ROS水平,多功能酶标仪检测足细胞谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase,GSH-PX）和超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2,SOD2）活性。Western Blot 法分析足细胞 Nox4、WT1、Nephrin和Desmin以及线粒体动力学相关蛋白MFN1、MFN2、OPA1、Drp1表达水平,荧光定量PCR法检测上述指标mRNA水平。采用线粒体红色荧光探针（MitoTracker?Red CMXRos）标记线粒体,激光扫描共聚焦显微镜观察足细胞线粒体形态,并对线粒体形态（tubular,mixed,fragmented）占比进行分析;应用JC-1线粒体膜电位检测试剂盒,流式细胞术观察足细胞线粒体膜电位（Mitochondrial Membrane Potential,MMP）变化;利用多功能酶标仪,生物发光法检测足细胞ATP水平。结果:1.HG组呈时间依赖性降低足细胞存活率;当含药血清浓度＞20%时,开始对足细胞活性产生明显影响。2.灰兜巴含药血清可减轻HG诱导足细胞凋亡情况。3.灰兜巴含药血清可降低HG诱导足细胞ROS生成水平,增强GSH-PX和SOD2活性,且HDBH组SOD2活性明显高于MET组（P＜0.01）。4.灰兜巴含药血清可下调HG诱导足细胞Nox4和Desmin蛋白表达水平,上调WT1和Nephrin蛋白表达水平;上述指标mRNA水平检测结果与此相互印证。5.灰兜巴含药血清可上调HG诱导足细胞MFN1、MFN2和OPA1蛋白表达水平,下调Drp1蛋白表达水平;上述指标mRNA水平检测结果与此相互印证。6.激光扫描共聚焦显微镜观察结果显示,灰兜巴含药血清可上调HG诱导足细胞tubular线粒体占比,下调fragmented线粒体占比,且HDBH组fragmented线粒体占比高于MET组（P＜0.05）。7.灰兜巴含药血清可明显改善HG诱导足细胞MMP和ATP水平下降情况,且HDBH组MMP、ATP水平均高于MET组（P＜0.01）。结论:HG可诱导足细胞线粒体动力学失衡,导致足细胞损伤和凋亡,灰兜巴含药血清可通过促进足细胞线粒体动力学平衡而减轻HG诱导的足细胞损伤和凋亡。第四章 灰兜巴对SD大鼠肝脏和肾脏的毒性作用研究目的:观察灰兜巴对大鼠肝脏和肾脏的毒性作用,为临床应用灰兜巴治疗DN提供安全性实验证据。方法:将40只SPF级健康SD大鼠（雌雄各半）随机分为空白对照组（Blank control group,BC）,溶媒对照组（Solvent control group,SC）,灰兜巴低剂量组（Low-dose of HDB group,HDBL）,灰兜巴高剂量组（High-dose of HDB group,HDBH）。根据临床有效剂量折算大鼠等效给药剂量,分别以该有效剂量的2倍,5倍剂量灌胃给药4周,停药观察2周。于药物干预结束前一天,每组随机选取6只大鼠,代谢笼收集24小时尿液,全自动生化分析仪检测尿液mAlb、Ucr,并计算mAlb/Ucr;麻醉大鼠后心脏取血检测肝脏功能指标（ALT、AST、ALP）和肾脏功能指标（SCr、BUN）。脱颈椎法处死大鼠剖腹取出肝脏和肾脏,称重并计算相应脏器指数,10%福尔马林中性固定液固定肝脏和肾脏,行HE染色,并于光镜下观察肝脏、肾脏组织病理学改变。剩余大鼠,同法处理,并检测上述指标。结果:灌胃给药期间大鼠状态良好,与BC组比较,脏器指数、肝脏、肾脏功能指标检测结果未见明显异常。光镜检测亦未见明显组织病理学改变。结论:灰兜巴干预SD大鼠4周,未引起明显肝脏、肾脏毒性损伤。该研究结果将为临床应用灰兜巴治疗DN提供安全性实验证据。