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研究背景:2018年,肝癌成为世界第六大癌症,也是全球癌症患者第四大死亡原因。肝癌易发生远处转移的特性是肝癌患者预后不良的重要原因之一,因此研究肝癌转移的发生发展机制对于治疗肝癌具有十分重要的意义。研究表明,很多肿瘤的发生与转移都是由于基因异常的选择性剪接造成的,而类固醇受体RNA激活剂1(SRA1)的3号外显子在肝癌中存在选择性剪接,其可能与肝癌的发生发展有着密切的联系。但是SRA1是一种新型的转录共激活剂,目前关于SRA1选择性剪接的机制尚不清楚,需要进一步进行研究。研究目的:本研究旨在探讨SRA1-L(包含3号外显子)与SRA1-S(不含3号外显子)之间的功能差异以及SRSF1(富含丝氨酸和精氨酸的剪接因子1)调控SRA1选择性剪接的具体分子机制,明确SRSF1-SRA1信号轴对肝癌细胞侵袭与转移能力的影响。本研究可为肝癌细胞转移机制的研究提供新的思路。研究方法:1.通过RT-PCR筛选在Hep G2和HCCLM3中存在可变剪接的基因来确定本课题的研究对象SRA1。2.通过公共数据库(UALCAN)分析肝癌临床样品中SRA1表达水平的差异,进一步判断SRA1是否与肝癌相关。3.我们通过以下实验证明SRA1异构体存在差异。通过多聚核糖体分析实验和CPAT网站预测SRA1异构体编码蛋白的能力;通过CCK8实验、划痕愈合实验以及体内肿瘤转移实验研究过表达或敲降SRA1异构体对肝癌细胞增殖、迁移与侵袭能力的影响;通过Western-blot实验研究SRA1异构体对下游AKT和ERK信号通路蛋白的影响;通过MS2-GFP-IP(MS2-GFP-免疫共沉淀)及Western-blot实验研究SRA1-L及SRA1-S异构体对PPARγ受体结合能力的差异;通过双萤光素酶报告基因检测SRA1-L及SRA1-S异构体对肿瘤转移相关基因转录的影响。4.为了初步验证在肝癌细胞中是什么调控SRA1 3号外显子的选择性剪接,我们做了以下相应实验。通过q PCR分析在LO2、Hep G2、HCCLM3细胞中存在差异表达的剪接因子;通过公共数据库(UALCAN)分析在正常样品和肝癌样品中存在差异表达的剪接因子;通过转录组测序分析在Hep G2、HCCLM3细胞中存在差异表达的剪接因子;通过RBP map生物信息学网站分析哪种剪接因子可以与SRA1存在结合,并对其结合位点进行分析;通过RT-PCR检测在肝癌细胞中过表达/敲降SRSF1、SRSF8、SRSF11对内源性SRA1-L/SRA1-S异构体表达水平的影响;在肝癌细胞过表达/敲降SRSF1后将pc DNA3.1-SRA1-minigene质粒转染至细胞中,使用特异性检测外源性SRA1-L/SRA1-S异构体的引物,通过q PCR实验检测SRSF1对外源性SRA1-L/SRA1-S异构体表达水平的影响;通过MS2-GFP-IP实验验证SRA1-minigene、SRA1-L、SRA1-S是否与SRSF1存在结合。5.为了进一步验证在SRSF1调控SRA1的3号外显子选择性剪接的具体分子机制,我们进行了以下实验。通过CLRIP(紫外交联RNA免疫共沉淀)实验验证SRSF1与SRA1pre-m RNA结合的序列区段;体外合成生物素标记的可能与SRSF1结合的SRA1pre-m RNA片段以及突变后的片段,随后通过RNA pulldown实验进一步确定SRSF1与SRA1 pre-m RNA的结合序列;6.为了确定SRSF1是否也可以促进肝癌细胞的侵袭,我们做了以下实验。通过CCK8实验、划痕愈合实验以及体内肿瘤转移实验研究过表达或敲降SRSF1对肝癌细胞增殖、迁移与侵袭能力的影响。通过Western-blot实验研究SRSF1对下游AKT和ERK信号通路蛋白的影响;7.最后,我们通过细胞侵袭实验以及体外肿瘤转移模型检测SRSF1和SRA1异构体表达水平的变化对肝癌细胞侵袭及转移的影响。研究结果:1.在HCCLM3细胞中SRA1-L的表达显著升高,而在HCCLM3细胞中SRA1-S的表达显著降低;2.相对于正常组织,肝癌样本中的SRA1的表达水平增加,并且在肝癌发展的4个阶段中的表达也均高于正常组织,其表达水平与肝癌的恶化程度呈正相关关系;3.SRA1-L具有编码蛋白的能力,SRA1-S不具有编码蛋白的能力;4.SRA1异构体对细胞增殖无明显影响;SRA1-L可以促进细胞迁移与侵袭,SRA1-S可以抑制细胞迁移与侵袭;SRA1-L可以增加磷酸化ERK和磷酸化AKT的表达,SRA1-S对磷酸化ERK和磷酸化AKT的表达无明显影响;SRA1-L可以与PPARγ结合;5.与Hep G2和LO2细胞相比,SRSF1在高转的肝癌细胞HCCLM3中表达量增加;与正常样本相比,SRSF1在肝癌样本中的表达量增加;6.在肝癌细胞中SRA1为SRSF1的下游靶基因之一,SRSF1可促进SRA1 Exon3的可变剪接进程;过表达SRSF1可促进内源性以及外源性SRA1-L异构体的生成;7.MS2-GFP-IP、CLRIP及RNA-pulldown实验结果表明SRSF1与SRA1 3号外显子中的“GGAACAGGCATTGGAAGA”序列存在结合;8.SRSF1可以促进肝癌细胞迁移与侵袭;SRSF1可以增加磷酸化ERK和磷酸化AKT的表达;9.SRSF1促进肝癌细胞的侵袭与转移部分依赖于SRA1-L的表达水平。结论:1.在肝癌细胞中SRA1存在选择性剪接;2.SRA1长短异构体在肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等进程中存在功能上的差异。SRA1-L异构体促进肝癌细胞进行侵袭与转移,而SRA1-S异构体则抑制肝癌细胞进行侵袭与转移。SRA1-L与受体PPARγ的结合能力更强;3.在肝癌细胞中SRA1为SRSF1主要的下游靶基因之一;SRSF1可促进SRA1 Exon3的可变剪接进程,使得肝癌细胞中SRA1-L异构体的表达水平升高;4.SRSF1的表达水平与肝癌的恶化程度呈正相关关系。SRSF1可促进肝癌细胞的迁移及侵袭;5.SRSF1对肝癌细胞迁移侵袭能力的影响部分依赖于其对SRA1的选择性剪接;