目的:为了提高外源基因在杜氏盐藻(简称盐藻)细胞中表达量,本论文从建立新型的盐藻自转化方法、采用细胞穿膜肽介导、联合细胞核定位肽应用等策略,进行外源基因对盐藻细胞的转化工作,力求提高外源基因的表达量。在获得高表达藻株的基础上,对转化株的遗传稳定性进行分析,最终制备高表达外源基因遗传稳定的转化盐藻藻株。方法:利用盐藻自身能够适应不同盐浓度的特性,当高盐浓度(1.0M)瞬时变为低盐浓度(0.1M)时,通过造成的渗透压差进行外源基因的转化工作。细胞外成份通过表面活性剂作用形成的孔洞进入细胞,外源物质进入细胞后,采用不同波长的荧光激发,在荧光显微镜下观察细胞核位置的荧光有无和强弱。没有引入外源物质的盐藻组作为阴性对照,同样进行相同的操作处理。为了获得最佳的转化结果,本论文对不同的转化参数进行了比较研究,对影响转化效率的四个参数(转化时间、盐梯度、染料剂量和Triton X-100浓度)分别进行了优化,观察不同转化参数对转化效率的影响,最终获得最高转化率的条件参数,供后续实验所用。在此最佳转化条件下,将含有外源基因的重组载体与细胞穿膜肽(TAT)、核定位肽(SVT40)联合应用,即盐藻细胞分别采用单独质粒(p CAMBIA1303)、质粒联合穿膜肽、质粒联合核定位肽进行转化,以期望获得更高的转化效率和外源基因的表达量。实验同时设有阴性对照组(加入其它质粒进行转化)和空白对照组(无质粒进行转化操作)。外源重组DNA进行盐藻转化后,经过72小时培养后离心收集细胞。采用组织化学染色和PCR扩增分析,检测外源基因(GUS基因)在盐藻细胞中的表达情况。细胞染色后在高倍镜下观察拍照,PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析和测序鉴定。同时,转化的细胞进行RT-PCR扩增分析,鉴定外源基因(GUS基因)在转录水平的表达情况。利用荧光定量PCR方法在不同组别中(单独质粒转化组、质粒联合TAT组、质粒联合SVT40组)筛选出外源基因表达量最高的转化藻株。随后,用Western blot方法进行最高表达株的蛋白产物分析,以鉴定表达量和生物活性。对于获得的最高表达株进行3-6个月的遗传稳定性分析,筛选获得高表达外源基因的遗传稳定性藻株。结果:利用盐梯度的变化,成功建立起了盐藻的盐梯度自转化方法。通过高盐浓度变为低盐浓度时,外源物质能够被自发的转入到细胞内部。结果显示:外源性物质被引入细胞后,盐藻细胞的细胞核位置在不同的荧光激发下,分别呈现红色和绿色强荧光;而阴性对照组细胞没有该荧光的发出,结果说明外源性物质被成功自发的引入盐藻细胞。通过对不同转化参数的优化研究(包括转化时间、盐梯度、染料量和Tritonx-100浓度等),结果显示:在四个转化参数中,盐浓度的变化对转化结果影响最大。第一,随着盐浓度由高到低逐渐降低时,转化细胞的数量显著增加。但是如果盐浓度小于0.1M,由于细胞破裂严重,无法统计转化情况;当盐浓度大于0.5M时,转化子的数量出现了明显减少的情况。第二,转化时间从60s到120s,转化细胞的数目显著增加。但是时间超过120s后,由于细胞大量破裂,转化细胞的数量并没有相应增加。第三,表面活性剂0.1%Triton X-100量从2μl(在转化体系中浓度为0.0005%)到10μl(在转化体系中浓度为0.001%)时,随着浓度的增加转化细胞的数目也明显增加。当0.1%Triton X-100量超过0.001%后,由于细胞大量破裂,转化细胞的数量并没有相应增加。第四,外界荧光染料(EB,1.25 mg/ml)在15μl至30μl时,随着浓度的增加转化细胞的数目明显增加,但是30μl之后同样因为细胞大量破裂,转化细胞的数量并没有相应增加。对上述四个参数优化后,最终确定的最佳转化条件:即盐藻在0.1M盐溶液培养基1ml(细胞数量达到10~6-10~7/ml)时,加入0.1%Triton X-100 10μl(在转化体系中浓度为0.001%)和1.25mg/ml EB 30μl,转化120s,获得了最高的转化效率,接近100%。基于上述最佳的转化参数,本研究进行了后续的转化工作。外源质粒转化盐藻后,结果显示:阳性细胞在显微镜下能够看到蓝色或浅蓝色染色结果,而阴性对照组和空白对照组细胞没有任何显色反应,细胞呈现浅黄色或黄褐色。PCR分析结果显示,在不同的转化藻株中,成功扩增出了大小为1807bp的GUS基因片段,而在阴性对照组和空白对照组中则没有条带的显示。由此可以看出,外源基因被成功转入盐藻细胞。外源质粒联合穿膜肽转化盐藻细胞后,同样得到上述的组织化学染色结果,荧光定量PCR筛选获得了表达量最高的藻株,该藻株与单独转化质粒组对比,GUS基因的表达量在转录水平得到了显著提高,达到了2.2～2.8倍。但是,Western blot结果中没有观察到蛋白表达量的差异,这可能与细胞的损伤作用较大有关。质粒联合核定位肽转化盐藻后,采用荧光定量PCR筛选也获得了表达量最高的藻株。该藻株与单独转化质粒组对比,发现在转录水平上GUS基因转录量得以提高达到了3.2～5.7倍,但是由于受到新型冠状病毒疫情的影响,进行Western blot的实验时间大大受限,结果中没有蛋白表达量的呈现,这是本课题研究遗憾的地方。还有通过对获得的外源基因表达量最高的转化株也需要进行了3个月以上,进而来分析在转录水平和翻译水平的稳定,从而获得短期稳定的遗传藻株。我们从实验可以看出,外源重组质粒联合核定位肽能够显著提高外源基因的表达量,为今后的外源蛋白重组生产奠定了工作基础。结论:成功建立了盐藻的自转化方法,并优化了不同的转化参数,获得了最佳的转化效率。通过新型转化方法能够实现盐藻细胞的高效转化,具有操作简单、经济实用、无需要贵重的仪器设备和实验耗材等优点,为盐藻的基因工程研究工作提供了一个有力的工具。采用外源质粒联合核定位肽的方法,可以提高目的基因在盐藻细胞的表达量。该核定位肽介导法是成功突破盐藻表达系统当前存在技术瓶颈的一次尝试,为今后高效利用盐藻表达系统进行外源蛋白的重组生产提供了借鉴和参考。