【摘 要】
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目的:近年来,有关托伐普坦（TVP）肝毒性等不良反应事件引起临床的广泛关注,但确切发病机制尚不明确。因此,本研究分别从动物和细胞水平上探讨炎症状态下TLR4介导托伐普坦致特异质药物型肝损伤的作用以及肝损伤机制,为同类药物诱导肝毒性的机制提供研究思路和理论依据。方法:（1）构建脂多糖（LPS）与托伐普坦共处理小鼠模型,考察造模后血浆生化指标和肝组织病理切片的变化,并通过UPLC-MS/MS方法检测肝
【基金项目】
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国家自然科学基金资助项目（No. 81302837, 81803834）； 湖北省重点研发计划项目（No. 2020BCB045）；
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目的:近年来,有关托伐普坦（TVP）肝毒性等不良反应事件引起临床的广泛关注,但确切发病机制尚不明确。因此,本研究分别从动物和细胞水平上探讨炎症状态下TLR4介导托伐普坦致特异质药物型肝损伤的作用以及肝损伤机制,为同类药物诱导肝毒性的机制提供研究思路和理论依据。方法:（1）构建脂多糖（LPS）与托伐普坦共处理小鼠模型,考察造模后血浆生化指标和肝组织病理切片的变化,并通过UPLC-MS/MS方法检测肝脏、胆汁和血浆中17种胆汁酸含量的变化以及考察炎症对小鼠体内托伐普坦药动学和组织分布的影响。（2）收集小鼠给药后的血浆、尿液和粪便,考察炎症状态对小鼠体内托伐普坦主要代谢途径和代谢产物的影响;运用网络药理学筛选出托伐普坦及其代谢物与药物性肝损伤（DILI）的核心靶点并进行通路富集分析,预测托伐普坦致特异质药物型肝损伤的潜在作用机制。（3）通过CCK8法和q PCR法筛选出最佳造模浓度,构建LPSTVP共处理小鼠原代肝细胞模型,通过ALT/AST试验进行模型验证;进一步通过q PCR和Western blot法检测小鼠原代肝细胞和肝组织中炎症调控通路、托伐普坦主要代谢酶以及胆汁酸调控通路中相关基因和蛋白表达水平,以研究脂多糖诱导炎症状态下TLR4介导托伐普坦致特异质药物型肝损伤的潜在作用机制。结果:（1）体内研究通过行为学观察、生化指标及病理切片分析发现,TLR4敲除型（TLR4-KO）小鼠相对于野生型（WT）小鼠,LPS+TVP组显著减轻了各生化指标的升高以及对肝细胞未造成明显损伤;胆汁酸检测及药代动力学研究发现,敲除TLR4不仅可显著缓解脂多糖诱导的炎症状态下托伐普坦引起的肝内胆汁酸浓度的升高及胆汁和血浆中胆汁酸浓度的降低,而且能显著提高小鼠体内托伐普坦的血药浓度以及降低各组织特别是肝组织中托伐普坦的浓度。（2）首次从小鼠口服托伐普坦后的血浆、尿液和粪便样品中鉴定出47种代谢物,其中血浆26种,尿液36种、粪便39种,主要包括羟基化、羧化、水解、葡萄糖醛酸化、乙酰化、甲基化等代谢反应。而炎症对托伐普坦在小鼠体内的代谢有明显抑制作用,减少了血浆、尿液和粪便中代谢物的种类;运用网络药理学预测发现托伐普坦可能通过调控细胞生长、胆汁分泌、炎症反应以及相关免疫反应来诱导肝损伤。（3）本研究筛选出LPS（100 ng/m L）联合TVP（6.25、12.5、25μM）构建小鼠原代肝细胞肝损伤模型,敲除TLR4可减轻联用组肝细胞培养上清液中ALT和AST指标的升高。对其机制进一步研究发现,脂多糖与托伐普坦联用增加了原代肝细胞和肝组织中炎症级联通路（My D88、NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6）的表达,此外还抑制了托伐普坦主要代谢酶Cyp3a11、胆汁酸主要转运体Ntcp、Bsep、Mrp2、核受体Fxr以及提高了胆汁酸合成酶Cyp7a1的基因和蛋白水平,而敲除TLR4可减轻这些基因和蛋白水平的变化。结论:本文通过构建LPS-TVP共处理体内外模型发现,在脂多糖诱导的炎症状态下,托伐普坦可通过TLR4信号级联通路激活下游NF-κB释放炎症因子,影响FXR介导的胆汁酸合成与转运进而导致肝损伤。而敲除TLR4可显著性减轻肝内胆汁酸的淤积,对托伐普坦诱导的肝损伤起到一定的保护作用。
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