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第一部分高糖对大鼠心肌细胞结缔组织生长因子表达的影响及其意义
目的:探讨高糖对培养的新生大鼠心肌细胞结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响及其在糖尿病性心肌纤维化中的作用。
方法:采用胰酶消化法和差速贴壁分离法获取心肌细胞,应用正常浓度糖(NG组,5mmol/L)、高糖(HG组,25mmol/L)、高糖加anti-CTGF中和抗体(Anti-CTGF+HG组)和甘露醇(Mannitol组,25mmol/L)孵育培养的心肌细胞。台盼蓝拒染法测定心肌细胞存活率,倒置显微镜下观察心肌细胞直径的变化;ELISA法测定心肌细胞培养上清液中Ⅲ型胶原蛋白(Col-Ⅲ)和纤维连接蛋白(FN)的含量,real-time RT-PCR、Westem blotting技术分别检测培养的心肌细胞CTGF mRNA和蛋白质的表达水平。
结果:(1)通过台盼蓝拒染法进行细胞计数发现,经过高糖孵育48小时后培养的大鼠心肌细胞存活率明显低于NG组(P＜0.01),并且心肌细胞直径也明显增加(P＜0.01),应用Anti-CTGF中和抗体干预后,可部分逆转高糖所导致的上述效应。(2)与正常浓度糖相比高糖孵育的心肌细胞,其培养上清液中的Col-Ⅲ蛋白和FN水平明显增加(P＜0.01),加入Anti-CTGF中和抗体共同孵育后,心肌细胞培养上清液中的Col-Ⅲ蛋白和FN的含量明显降低(P＜0.01),但仍高于NG组(P＜0.01)。(3)用含正常浓度糖培养液培养的NG组心肌细胞有少量的基础CTGFmRNA和蛋白表达;与NG组相比,用高糖干预后心肌细胞CTGFmRNA和蛋白表达明显增加,并且随着干预时间的延长,其表达水平也随之逐步升高(P＜0.05或P＜0.01);而与NG组相比,用和高糖具有相同浓度的甘露醇干预后,心肌细胞的CTGF mRNA和蛋白表达无明显差异(P＞0.05),排除了高糖是通过升高的渗透压来影响心肌细胞CTGF表达的。应用高糖和Anti-CTGF中和抗体共同孵育心肌细胞48小时后,和单纯高糖孵育组(HG)相比,Anti-CTGF+HG组的CTGF的基因和蛋白表达被明显抑制(P＜0.01),但仍高于基础表达水平(P＜0.05)。
结论:高糖可上调培养的新生大鼠心肌细胞的CTGF基因和蛋白的表达,并能促进心肌细胞合成Ⅲ型胶原和纤维连接蛋白。高浓度糖所导致的心肌细胞肥大、存活率降低以及Ⅲ型胶原和纤维连接蛋白合成增加,部分是由CTGF所介导的,应用Anti-CTGF抗体进行干预可抑制高糖的上述效应。
第二部分氨基胍对糖尿病大鼠心肌纤维化和结缔组织生长因子表达的干预作用
目的:探讨氨基胍对糖尿病大鼠心肌纤维化和结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响及其作用机制。
方法:雄性SD大鼠34只,随机分成正常对照组(CON,n=10)、糖尿病组(DM,n=12)和糖尿病氨基胍干预组(AG,n=12)。DM组和AG组采用链脲佐菌素(STZ)一次性腹腔注射建立糖尿病动物模型。12周后采用微导管介入技术检测大鼠血流动力学指标并测定心脏体重比(H/B);全自动生化仪上检测空腹血糖(FBG)、荧光分光光度法检测血清糖基化终产物(AGEs)、免疫比浊法检测糖化血红蛋白(GHb);天狼猩红染色检测左室心肌胶原含量;透射电镜观察心肌细胞超微结构;免疫组化或免疫荧光染色检测心肌组织纤维连接蛋白质(FN)和Ⅲ型胶原(Col-Ⅲ)的表达;利用real-time RT-PCR、Western blowing技术,分别检测大鼠心肌组织CTGF、转移生长因子β1(TGF-β1)mRNA和蛋白质的表达水平。结果:(1)与CON组相比,DM组大鼠血清AGEs的荧光值、FBG和GHb水平均明显升高(P＜0.01);并且DM组大鼠左心室收缩压(LNSP)、左室压力最大上升和下降速率(±dp/dtmax)明显下降,而左室舒张末期压(LVEDP)明显升高(P＜0.01);同时DM组大鼠心肌组织胶原含量、H/B、Col-Ⅲ和FN表达水平均明显高于CON组(P＜0.01);电镜下DM组大鼠心肌间质胶原纤维增生,心肌细胞排列紊乱,肌原纤维呈灶性溶解,肌丝扭曲、断裂;而DM组大鼠心肌组织CTGF、TGF-β1 mRNA和蛋白质表达水平也均明显高于CON组P＜0.01)。(2)应用氨基胍干预后发现:与DM组相比,AG组大鼠血清FBG和GHb水平无明显变化(P＞0.05),而血清AGEs的荧光值、H/B、心肌组织Col-Ⅲ和FN表达水平均明显降低(P＜0.05),但仍高于CON组(P＜0.01或P＜0.05);AG组心肌组织胶原含量也明显减低(P＜0.05),电镜下心肌细胞超微结构明显改善,并接近正常;并且AG组大鼠LVSP、±dp/dtmax和LVEDP等心功能指标明显改善(P＜0.05),心肌组织CTGF、TGF-β1 mRNA和蛋白质表达水平均明显降低(P＜0.05),但均未能恢复到正常水平。
结论:AGEs在糖尿病心肌纤维化中起重要作用,其作用机制可能与上调心肌组织CTGF的表达有关;氨基胍可通过抑制糖基化终产物的形成来降调心肌组织的CTGF的表达,从而逆转糖尿病大鼠心肌间质纤维化并改善心脏功能。
第三部分氟伐他汀对糖尿病大鼠心肌纤维化和结缔组织生长因子表达的影响及其机制研究
目的:探讨氟伐他汀对糖尿病大鼠心肌间质纤维化、结缔组织生长因子(CTGF)的表达以及心脏结构和功能的影响及其作用机制。
方法:10周龄清洁级雄性SD大鼠28只,随机分为正常对照组(CON组,n=8)、
糖尿病组(DM组,n=11)、糖尿病氟伐他汀治疗组(Flu组,n=9)。DM组和Flu组采用链脲佐菌素(STZ)一次性腹腔注射建立糖尿病模型动物模型。12周后检测大鼠血流动力学指标和心脏体重比(H/B);全自动生化仪检测:空腹血糖(FBG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)及高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C);用免疫比浊法测糖化血红蛋白(GHb);分光光度法检测血清超氧化物歧化酶(SOD)的活性和丙二醛(MDA)含量;ELISA法检测血清中单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、肿瘤坏死因子(TNF-α)水平;利用天狼猩红染色检测心肌胶原容积分数(CVF),氯氨T法测定心肌羟脯氨酸含量;透射电镜观察心肌细胞超微结构;免疫组化或免疫荧光染色检测心肌组织纤维连接蛋白(FN)、CTGF和RhoA蛋白的表达;Pull down assay法检测大鼠心肌组织中的RhoA蛋白活性;利用real-time RT-PCR、Western blotting技术,检测大鼠心肌组织CTGF、TGF-β1 mRNA和蛋白质的表达水平。
结果:(1)12周末DM组和Flu组FBG和GHb水平明显升高,与CON组相比差别有统计学意义(P＜0.01);Flu组和与DM组之间FBG和GHb水平无明显差别;DM组血脂异常以TG增高明显,TC、LDL-C增高,HDL-C降低(P＜0.01);氟伐他汀治疗使TC和LDL-C均显著下降(P＜0.05)。与CON组相比,DM组血清中SOD活性明显降低(P＜0.01),MDA含量明显增高(P＜0.01);与DM组比较,应用氟伐他汀干预后Flu组SOD活性明显升高(P＜0.05),MDA含量则明显降低(P＜0.05)。与CON组相比,DM组大鼠血清MCP-1、TNF-α水平明显升高(P＜0.01);而与DM组相比,应用氟伐他汀干预后,Flu组血清中MCP-1、TNF-α水平均明显降低(P＜0.05)。(2)与CON组比较,DM组大鼠左心室收缩压(LVSP)、左室压力最大上升和下降速率(±dp/dtmax)明显下降,而LVEDP明显升高(P＜0.01);与DM组相比,Flu组LVSP、±dp/dtmax明显升高,LVEDP明显下降(P＜0.05),但是Flu组LVEDP仍高于CON组,±dp/dtmax则低于CON组(P＜0.05)。同时DM组H/B、大鼠心肌组织CVF、心肌羟脯氨酸和相应的胶原总含量均明显高于CON组(P＜0.01),加用氟伐他汀治疗后上述指标明显降低(P＜0.05)。(3)免疫组化或免疫荧光染色显示DM组心肌组织FN、CTGF和RhoA蛋白表达明显增加,Pulldown assay法检测心肌组织RhoA蛋白活性也相应增加,并且Western blotting检测也显示DM组大鼠心肌组织CTGF和TGF-β1蛋白表达水平均较CON组明显增加(P＜0.01),同时CTGF和TGF-β1mRNA表达水平均明显高于CON组(P＜0.01);应用氟伐他汀进行干预治疗后,上述异常均明显减轻(P＜0.05)。
结论:氧化应激、炎症因子、致纤维化生长因子(CTGF和TGF-B1等)和Rho/Rho蛋白激酶信号通路相互作用,共同参与了糖尿病性心肌纤维化的发生和发展,Rho/Rho蛋白激酶信号通路在其中可能起中心作用;氟伐他汀可通过抑制RhoA的活性和表达,来降调糖尿病大鼠心肌组织CTGF和TGF-B1的表达,抑制心肌间质纤维化,改善心功能;Rho/Rho蛋白激酶信号通路可能成为治疗糖尿病性心肌纤维化一个重要的新靶点。
总之,CTGF在糖尿病性心肌纤维化的发病中起着重要作用,糖尿病常见的高血糖和升高的AGEs可上调心肌组织或心肌细胞的CTGF表达,同时Rho/Rho蛋白激酶通路对CTGF的表达调控起着重要作用;CTGF和TGF-β1相互作用可导致糖尿病心肌间质纤维化,并导致心脏结构和功能异常,心肌细胞通过上调自身的CTGF的表达主动参与了这一过程。应甩AGEs的抑制剂和Rho蛋白激酶抑制剂他汀类药物可通过不同的作用机制来抑制CTGF和TGF-β1的表达,从而阻止糖尿病心肌纤维化,预防和延缓糖尿病性心肌病的发生和进展。