铅是一种常见的神经毒物,对神经系统具有异常亲和力,可诱发严重的神经功能障碍和学习认知功能损伤。学习记忆和认知是高级中枢神经系统功能的基本体现。海马不仅是学习记忆发生与认知功能塑形的关键场所,也是铅神经毒性作用的主要靶位点。胰岛素/Pi3k/Akt和MAPKs信号通路的活化表达是细胞增殖、分化、凋亡、迁移等过程发生和发展的分子基础,其表达紊乱或活化异常可导致一系列疾病状态及病理表现的发生。阿尔茨海默症(Alzheimer‘s disease,AD)是一种原发型进行性神经退行性疾病,其发病受环境和遗传因素的共同调节。进行性认知功能障碍,及学习记忆能力损伤是AD的典型临床症状,该过程中常伴随Tau蛋白过磷酸化、神经元大量凋亡、突触结构/功能退化及通路蛋白表达异常。虽然AD发病机制尚不清楚,但大量研究数据提示,Aβ表达异常和蓄积可能是各种原因诱导AD发病的共同通路。近期研究发现,AD可能并不属于单纯的老年型疾病,其发病亦具有一定的胚胎源性,这符合成人疾病的胚胎基础假说(Fe BAD)的论述。已知孕哺期铅暴露会诱发严重影响子代中枢神经系统的正常发育;且人群研究结果证实发育早期铅暴露与儿童智力损伤,空间学习记忆能力障碍、认知和注意力下降具有强相关性,但该机制尚不十分清楚。本研究拟运用小鼠孕哺期铅暴露模型和PC12细胞染毒模型,检测孕早期铅暴露对子代小鼠血铅和海马铅含量、海马Aβ相关蛋白(IDE)和学习记忆相关蛋白(NGF)表达的影响;结合体外实验,观察铅暴露对神经细胞生长发育的影响,探讨该过程中可能涉及的AD相关蛋白,神经发育相关因子及MAPKs信号通路蛋白表达变化,对铅的细胞和神经毒性进行阐述和分析,为AD发病机理的探讨及神经功能修复提供理论依据。目的1.通过构建铅中毒动物模型,比较孕哺期铅暴露对仔鼠学习记忆能力的影响,检测各浓度铅暴露组海马IDE和NGF的差异表达,评估孕哺期母体铅暴露对子代小鼠神经元发育和功能表达的影响,进而说明铅的致AD样病变作用。2.通过构建体外细胞染毒模型,分析对比不同剂量及不同时间铅暴露对AD相关细胞因子,神经发育相关因子和胞内信号蛋白表达的影响,探索铅暴露对Aβ及其衍生物表达的影响,说明铅致AD样病变作用并探讨其对信号传导通路表达的影响,为AD的防治和铅毒性的干预治疗提供线索。材料与方法1研究对象动物模型:将怀孕SPF级昆明小鼠随机分为4组,每组10只,1个对照组及3个铅暴露组。孕鼠自怀孕第1d起(E0)至仔鼠断乳时,分别给予醋酸铅含量为0%(对照组)、0.1%(低剂量组)、0.2%(中剂量组)和0.5%(高剂量组)的去离子饮用水。仔鼠出生后仍由母鼠喂养照料至PND21。细胞株:选用褐家鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞株作为实验对象,经分化处理后,分别给予终浓度为0μM、20μM、100μM和500μM的醋酸铅染毒。2.方法2.1动物实验2.1.1采用Z-5000石墨炉原子吸收光谱仪测定仔鼠血铅和海马铅浓度。2.1.2采用Morris水迷宫实验评价仔鼠的学习记忆能力。2.1.3采用Western Blot检测IDE和NGF在不同剂量铅暴露组中的表达量。分别采用免疫组化和免疫荧光技术对IDE和NGF在海马组织中的分布和表达进行了描述(对照组和高剂量组)。2.2细胞实验2.2.1采用MTT法检测不同暴露浓度及暴露时间对细胞活性的影响。2.2.2采用Western Blot技术检测AD相关蛋白(Aβ和Aβ寡聚体),神经发育相关蛋白(IGF1/IGF1R)及胞内信号通路相关蛋白(IR、p-Akt、IDE、ERK1/2、JNK1/2/3、P38)蛋白表达的改变,采用实时定量PCR分析APP、INSR、IDE和IGF1/IGF1R基因m RNA的表达。3.统计分析实验使用SPSS 21.0软件包(SPSS Inc,USA)进行统计分析,两组数据比较采用独立样本t检验,多组数据间比较采用单因素方差分析,两两比较使用Bonferroni检验法,若不满足正态分布,则使用秩和检验,若数据满足正态分布则以均数±标准差(x±s)表示,检验水平为α=0.05。结果1.动物实验结果1.1孕哺期母体铅暴露对仔鼠血铅、海马铅含量及其学习记忆能力的影响不同剂量孕哺期铅暴露后,PND21仔鼠血铅和海马铅含量显著高于对照组(P<0.05)。Morris水迷宫结果显示,中、高暴露剂量组仔鼠的逃避潜伏期和错误次数均显著高于对照组(P<0.05)。1.2.孕哺期母体铅暴露对仔鼠海马组织IDE和NGF蛋白表达的影响1.2.1 Western Blot结果显示,各铅暴露组仔鼠海马IDE和NGFβ蛋白表达水平较对照组均明显降低(P<0.05)。1.2.2免疫组化结果显示,高剂量铅暴露组仔鼠海马CA1区NGF免疫组化阳性反应物的平均灰度值明显低于对照组(P<0.05)。1.2.3免疫荧光实验结果显示,高剂量铅暴露组仔鼠海马神经元活性剂IDE免疫荧光抗体的平均光密度均显著低于对照组(P<0.05)。2.细胞实验结果1.醋酸铅处理对PC12细胞增殖的影响根据细胞的数量变化及形态学改变最终选择0μM、20μM、100μM和500μM醋酸铅暴露浓度及12h、24h和72h来开展后续研究。2.醋酸铅处理对PC12细胞Aβ和Aβ寡聚体表达的影响不同浓度醋酸铅暴露12h后,500μM染铅组PC12细胞Aβ的表达低于对照组(P<0.05);Aβ寡聚体蛋白在20μM染铅组细胞中的表达低于对照组(P<0.05),100μM和500μM染铅组PC12细胞Aβ蛋白的表达水平高于对照组(P<0.05)。染毒24h后,各染铅组细胞Aβ的表达水平均低于对照组(P<0.05);Aβ寡聚体蛋白在各染铅组细胞中的表达无明显改变(P>0.05)。染毒72h后,Aβ蛋白在100μM和500μM染铅组细胞中的表达低于对照组(P<0.05);Aβ寡聚体蛋白在各染铅组细胞中的表达均高于对照组(P<0.05)。3.醋酸铅处理对PC12细胞IGF1/IGF1R表达的影响醋酸铅暴露12h后,20μM染铅组PC12细胞IGF1的表达高于对照组(P<0.05),IGF1和IGF1R蛋白在100μM和500μM染铅组细胞中的表达均低于对照组(P<0.05)。染毒24h后,IGF1蛋白在各染铅组细胞中的表达均低于对照组(P<0.05);IGF1R蛋白在20μM和500μM染铅组细胞中的表达低于对照组(P<0.05)。染毒72h后,IGF1蛋白在各染铅组细胞中的表达均低于对照组(P<0.05);100μM和500μM染铅组细胞IGF1R的表达低于对照组(P<0.05)。4.醋酸铅处理对PC12细胞IR、p-Akt、IDE表达的影响染毒12h后,20μM染铅细胞IR的表达低于对照组(P<0.05),100μM染铅组细胞IR和p-Akt蛋白表达水平均高于对照组(P<0.05);500μM染铅组细胞p-Akt的表达低于对照组(P<0.05);500μM染铅组细胞IDE的表达低于对照组(P<0.05)。染毒24h后,20μM及100μM染铅组细胞IR的表达低于对照组(P<0.05);p-Akt蛋白在20μM和100μM染铅组细胞中的表达显著高于对照组(P<0.05),500μM染铅组细胞p-Akt的表达量则明显低于对照组(P<0.05);IDE蛋白在各染铅组细胞中的表达均低于对照组(P<0.05)。染毒72h后,IR蛋白在20μM和500μM染铅组细胞中的表达低于对照组(P<0.05);p-Akt蛋白在500μM染铅组细胞中的表达低于对照组(P<0.05);100μM及500μM染铅组细胞IDE的表达低于对照组(P<0.05)。5.醋酸铅处理对PC12细胞MAPK信号通路相关蛋白(ERK1/2、JNK1/2/3、P38)表达的影响不同浓度醋酸铅处理12h后,与对照组比较,各染铅组细胞ERK1的表达增高,而ERK2和P38蛋白表达降低(P<0.05);500μM染铅组细胞JNK1的表达低于对照组(P<0.05);20μM及100μM染铅组细胞JNK2的表达高于对照组(P<0.05);100μM及500μM染铅组细胞JNK3的表达低于对照组(P<0.05)。染毒24h后,与对照组比较,20μM染铅组细胞ERK1表达显著升高,而500μM染铅组细胞ERK1蛋白表达降低(P<0.05);ERK2蛋白在各染铅组细胞中的表达均低于对照组(P<0.05);100μM及500μM染铅组细胞JNK1的表达低于对照组(P<0.05);500μM染铅组细胞JNK2蛋白的表达低于对照组(P<0.05);20μM及500μM染铅组细胞JNK3的表达低于对照组(P<0.05);P38蛋白在100μM和500μM染铅组细胞中的表达低于对照组(P<0.05)。染毒72h后,与对照组比较,各染铅组细胞ERK2及JNK1蛋白的表达均降低(P<0.05);500μM染铅组细胞ERK1的表达低于对照组(P<0.05);100μM染铅组细胞JNK2的表达高于对照组(P<0.05),500μM染铅组细胞JNK2的表达低于对照组(P<0.05);JNK3蛋白在100μM及500μM染铅组细胞中的表达均低于对照组(P<0.05);100μM及500μM染铅组细胞P38的表达低于对照组(P<0.05)。6.醋酸铅对PC12细胞APP、INSR、AKT、IDE和IGF1/IGF1R转录水平的影响PCR结果显示,醋酸铅处理12h后,APP m RNA在各染铅组细胞中的表达无明显改变(P>0.05);20μM染铅组细胞INSR m RNA的表达低于对照组(P<0.05);各染铅组细胞AKT m RNA的表达均低于对照组(P<0.05);各实验组细胞IDE m RNA的表达无显著差异(P>0.05);20μM和100μM染铅组细胞IGF1/IGF1R m RNA的表达均低于对照组(P<0.05)。染毒24h后,20μM及100μM染铅组细胞APP m RNA的表达高于对照组(P<0.05);100μM染铅组细胞INSR m RNA的表达低于对照组(P<0.05);20μM及100μM染铅组细胞AKT m RNA的表达低于对照组(P<0.05);20μM染铅组细胞IDE m RNA的表达低于对照组(P<0.05);100μM染铅组细胞IGF1 m RNA的表达低于对照组(P<0.05),各实验组细胞IGF1R m RNA的表达无明显差异(P>0.05)。染毒72h后,20μM及100μM染铅组细胞APP m RNA的表达均低于对照组(P<0.05);仅20μM染铅组细胞INSR m RNA的表达低于对照组(P<0.05);AKT m RNA在20μM及100μM染铅组细胞中的表达低于对照组(P<0.05);IDE m RNA在各实验组中的表达无明显改变(P>0.05);20μM和100μM醋酸染铅组细胞IGF1/IGF1R m RNA的表达均低于对照组(P<0.05)。结论1.孕哺期母体铅暴露可导致仔鼠血铅和海马铅浓度明显升高,抑制Aβ降解酶IDE及神经生长因子NGF的表达,损伤仔鼠的空间学习能力,该损伤效应呈暴露浓度依赖性。提示子代学习记忆能力障碍、脑AD样神经退行性变与孕哺期母体铅暴露密切相关。2.细胞染毒实验结果与动物研究结果相一致。醋酸铅暴露会对PC12细胞AD相关蛋白表达产生影响,该过程可能涉及胞内信号通路蛋白的异常表达。铅暴露在抑制ERK2、JNK1/3及P38蛋白表达的同时,刺激了ERK1和JNK2 MAPKs的表达。说明铅暴露可通过诱发信号通路表达异常来诱导AD样病变的产生。