中华绒螯蟹俗称河蟹,是我国重要经济甲壳动物之一,其经济价值主要与其大小规格相关,大规格蟹价格远远高于小规格蟹。中华绒螯蟹的生长具有周期性蜕皮非连续的阶段性生长的特点,从幼蟹到成蟹的生长阶段,要经历15-16次蜕皮。每次蜕皮都启动渗透压快速调节机制,并伴随身体快速吸水和膨胀,成蟹规格由每次蜕皮吸水膨胀后的增长加和决定。迄今,对中华绒螯蟹蜕皮周期相关的渗透调节机制了解甚少。对中华绒螯蟹蜕皮过程中渗透调节机制的研究将有助于实现人工控制生长,提高成蟹规格和养殖效益。本论文在测定和分析了中华绒螯蟹蜕皮进程中(蜕皮后期(A期),蜕皮间期(C期),蜕皮前期(D期)和蜕皮期(E期))体内环境渗透压和相关生理生化指标变化的基础上,开展了对不同蜕皮时期鳃组织转录组学与蛋白质组学的联合分析,利用邻接法等生物信息学手段构建了中华绒螯蟹蛋白互作网络并提取了渗透压调控子网络,分析和验证了中华绒螯蟹渗透压调节的关键基因,构建了中华绒螯蟹渗透调控模型,为进一步了解中华绒螯蟹蜕皮期间渗透压调控的分子机制奠定了基础。主要结果和结论如下:1.中华绒螯蟹脱皮生长过程中血淋巴渗透压发生明显变化中华绒螯蟹呈不连续阶段性跳跃式增长,每蜕皮一次,由于身体快速吸水膨胀便长大一次,最终成蟹的大小规格依赖每次蜕皮的增长率。由于人们对血淋巴渗透压变化与蜕皮增长的相关性了解甚少。本研究通过显微观察法对中华绒螯蟹进行了蜕皮周期分期,测定了不同蜕皮时期幼蟹血淋巴渗透压及蜕皮前后主要生长指标的变化,并进行了相关性分析。结果表明,幼蟹蜕皮前后,体长、体宽和体高等生长指标发生明显变化,呈现跳跃式增长。雄蟹平均体长、体宽和体高分别增长5.565%、6.643%和5.768;雌蟹平均体长、体宽和体高分别增长8.17 1%、9.956%和8.006%。伴随蜕皮周期,其血淋巴呈周期性变化。蜕皮间期和蜕皮前期的渗透压最高;蜕皮期渗透压水平最低,蜕皮期的渗透压水平显著低于蜕皮间期和前期(P<0.05);蜕皮后期渗透压逐渐升高。这些结果提示,蜕皮启动了渗透压调节,并利用渗透调节快速吸水,使身体膨胀,实现跳跃式增长。2.中华绒螯蟹不同蜕皮时期血淋巴渗透压调节的生理水平研究中华绒螯蟹血淋巴的渗透压在蜕皮周期中发生了明显的变化,并为阶段性和跳跃式增长提供了可能。但是,人们对调控血淋巴渗透压变化的生理因子的了解很少。本研究以幼蟹为实验材料,测定了不同蜕皮时期的血淋巴主要离子浓度、游离氨基酸含量等生理因子的变化,以期了解引起渗透压伴随蜕皮周期性变化的生理机制,并为探讨渗透压调节的分子机制奠定基础。结果表明:(1)Na+和Cl_是调节渗透压变化的主要血淋巴生理因子,在不同蜕皮时期血淋巴中的浓度呈显著性变化。与蜕皮间期相比,蜕皮前期血淋巴Na+浓度显著升高(P<0.05),到蜕皮期又显著下降(P<0.05),至蜕皮后期Na+浓度降至最低值;蜕皮前期血淋巴Cl_浓度显著低于后期、间期和蜕皮期(P<0.05)。其它离子也参与了渗透压的调节。其中,蜕皮后期和蜕皮前期血淋巴K+浓度最高,蜕皮期显著下降(P<0.05),蜕皮间期K+浓度最低,显著低于其他三个蜕皮时期(P<0.05);蜕皮前期和蜕皮期的Ca2+浓度显著高于蜕皮后期和蜕皮间期;蜕皮期血淋巴Mg2+浓度最高,到蜕皮后期显著降低,蜕皮间期和蜕皮前期浓度最低(P<0.05)。(2)游离氨基酸在中华绒螯蟹渗透压调节中也发挥了重要作用。在蜕皮后期、蜕皮间期、蜕皮前期及蜕皮期,中华绒螯蟹血淋巴FAAs总量分别为2.8830 mM、1.4947 mM、2.1104 mM和3.7826 mM。蜕皮期的总FAAs含量最高,蜕皮间期的总FAAs含量最低,且二者差异显著(P<0.05)。天冬氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、赖氨酸和精氨酸是中华绒螯蟹FAAs的重要成分,其在不同蜕皮时期血淋巴中的含量差异显著,且在蜕皮期的含量高于蜕皮间期和蜕皮前期,剩余其他FAAs均具有相同趋势。3.中华绒螯蟹后鳃组织转录组学与蛋白质组学的联合分析中华绒螯蟹渗透压调节的分子机制复杂,并与蜕皮生长和代谢关联密切。为系统探讨中华绒螯蟹渗透压调控的分子机制,本研究以不同蜕皮时期和不同血淋巴渗透压状态下的后鳃组织为实验材料,构建了 RNA-Seq测序文库,联合iTRAQ/LC-MS/MS蛋白质组鉴定技术,完成了转录组和蛋白质组高通量测序和鉴定,并进行了渗透压调节相关的生物信息学分析。主要结果和结论有:(1)转录组分析结果显示:A、C、D 和 E 期分别获得 112,406,504、98,690,970、90,634,634和115,833,814条原始序列。通过拼接、注释和比较分析,共得到4813个差异基因。其中Avs.C共有2,751个差异基因,其中1,475个基因上调,1,276个基因下调;C vs.D共有差异基因97个,其中上调基因65个,下调基因32个;D vs.E共有差异基因2,925个,其中上调基因1,352个,下调基因1,573个;E vs.A组共有324个差异基因,其中171个基因上调,153个基因下调。蜕皮期高表达差异基因显著富集到了胰高血糖素信号通路中,这说明中华绒螯蟹渗透调节可能受神经内分泌系统调控;另外,差异基因也显著富集到醛固酮的合成和分泌通路、胃酸分泌、唾液分泌等离子稳态相关的代谢通路和多个氨基酸代谢通路;同时,还发现了磷脂酰肌醇磷脂酶C-β(PLCβ)、钙调蛋白(CALM)和蛋白激酶C(PKC)等参与渗透调节的基因。(2)蛋白质组分析结果显示:共鉴定到蛋白2,321个,相对分子质量集中在10-100 kDa之间,肽段长度为5-44个氨基酸。通过比较分析,C vs.A统计得到差异蛋白141个,其中上调蛋白61个,下调蛋白80个;D vs.C共有差异蛋白42个,其中上调蛋白22个,下调蛋白20个;E vs.D获得差异蛋白176个,其中上调蛋白124个,下调蛋白52个;E vs.A共有差异蛋白49个,其中上调蛋白35个,下调蛋白14个。蜕皮期高表达基因显著富集于H+跨膜运输、一价无机阳离子运输、质子转运、跨膜运输等渗透调节相关GO term中,这些term都与离子等物质的跨膜运输相关。(3)转录组和蛋白质组联合分析结果显示:mRNA和蛋白质表达量差异主要集中在C vs.A和E vs.D中。其中A期有一致上调基因和蛋白19个,下调基因和蛋白11个;E期有一致上调基因和蛋白18个,下调基因和蛋白3个。蜕皮期上调基因显著富集到氨基糖和核苷酸糖代谢、蛋白质消化吸收、脂肪酸降解等通路,与离子、碳水化合物、脂质和次级代谢产物的运输和代谢等相关,这些基因可能在中华绒螯蟹渗透调节中发挥一定作用。其中的钙激活氯离子通道4是一种广泛存在的氯离子通道,参与氯离子的运输,在渗透压调节中扮演重要角色。4.中华绒螯蟹渗透压调控网络的构建与关键基因的挖掘与验证基于转录组和蛋白质组数据分析结果,采用邻接法等生物信息学手段,我们构建了中华绒螯蟹蛋白互作网络和渗透压调节子网络,并综合不同蜕皮时期的血淋巴生理变化、渗透调控相关候选基因的转录表达水平、组学差异基因和蛋白富集分析,构建了中华绒螯蟹渗透调控模型,从生理和分子层面初步阐述了中华绒螯蟹蜕皮时期渗透调节机制。主要结果结论有:(1)筛选获得渗透调节相关重要候选基因8个,包括5-羟色胺受体(HTR2)、腺苷酸环化酶8(ADCY8)、钙调蛋白(CALM)、钠钾ATP酶α亚基(ATP1A)、钙激活氯离子通道蛋白4(CLCA4)、唾液酸转运蛋白Sialin(SLC17A5)、ATP结合盒式蛋白B亚组成员8(ABCB8)和水通道相关蛋白(AQPN),测定其在中华绒螯蟹不同蜕皮时期后鳃组织中的转录表达水平,同时测定Na+/K+-ATPase在不同蜕皮时期的酶活力变化,开展了渗透压转录表达调控分析。(2)蜕皮前期ATP1A的表达量最高,蜕皮前期、蜕皮期和蜕皮后期表达量显著高于蜕皮间期。蜕皮期SLC17A5的表达量最高,显著高于蜕皮后期、间期和前期。AQPN在蜕皮期的表达量最低,显著低于蜕皮后期。CLCA4和ABCB8在蜕皮前期的表达量最高,显著高于其它三个时期。ADCY8、CALM和HTR2的也在蜕皮前期中表达量最高。(3)中华绒螯蟹鳃上皮Na+/K+-ATPase活性在不同蜕皮时期差异显著(P<0.05)。在一个蜕皮周期中,蜕皮前期鳃Na+/K+-ATPase活性显著高于其他三个蜕皮时期。这一结果和ATP1A转录表达量变化趋势大致相同,也与血淋巴Na+浓度变化相对应。(4)探讨和提出了中华绒螯蟹蜕皮过程中的渗透压调节机制。蜕皮过程启动时,在神经递质、激素调控作用下,5-轻色胺(5-HT)受体HTR2表达量显著升高,5-HT与HTR2结合后,促使腺苷酸环化酶表达量升高;腺苷酸环化酶合成胞内第二信使cAMP,通过cAMP与蛋白激酶A(PKA)耦联使PKA磷酸化,从而激活Na+-K+-ATPase、Cl-通道等转运酶、转运蛋白和通道蛋白,实现离子和物质的跨膜运输。另一方面,在启动蜕皮时,钙调蛋白表达量也显著升高。5-HT与膜受体HTR2结合,激活质膜上的磷脂酶C,产生1,4,5-三磷酸肌醇,开启钙通道,使胞内Ca2+浓度升高,钙调蛋白CALM结合钙离子发生构象改变,激活钙调素依赖性激酶CAMK,从而激活离子转运酶,最终实现渗透平衡。中华绒螯蟹协同体内不同物质(神经递质、离子、FAA、水等)在不同水平上(生理、分子水平)进行渗透调控,以保障各项生命活动顺利进行。