论文部分内容阅读
背景与目的痒觉是一种由内部或外部刺激引起不适进而引发搔抓意愿的感觉。瘙痒症常见于皮肤、粘膜或系统性疾病,是困扰人类的健康难题之一。目前研究认为,与痛的神经机制类似,位于皮肤或粘膜的外周无髓鞘C类神经纤维末梢的痒觉感受器被致痒介质直接或间接激活产生痒觉。在各种瘙痒症中,由过敏性疾病引起的过敏性瘙痒最为常见,而现有的抗过敏药物治疗往往效果欠佳。过敏性疾病的特征之一是血清或受累组织中抗原特异性免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig)尤其是免疫球蛋白E(IgE)的增高。既往研究表明,部分外周痛觉传入神经元表达IgG Fc高亲和力受体Fc-gamma-receptor I (FcγRI),并可以被IgG免疫复合物特异性激活,从而直接引起痛觉神经元兴奋性升高和放电。有研究发现IgE的高亲和力激活受体Fc-epsilon-receptor I (FcεRI)在部分外周感觉神经元上表达。我们假设外周感觉神经元表达的FcεRI可以被IgE免疫复合物激活,从而参与过敏性瘙痒的发生。本研究的目的是探讨在外周感觉神经元表达的FcεRI参与过敏性瘙痒的发生机制。材料与方法采用鸡卵清蛋白(OVA)和免疫佐剂(氢氧化铝)皮下注射致敏小鼠。OVA致敏原滴眼激发过敏症状,建立小鼠过敏性眼部瘙痒模型。使用OVA和小鼠抗OVA IgE型抗体制备IgE-免疫复合物(IC)。采用在体和离体实验研究小鼠瘙痒相关行为、Fc受体在小鼠三叉神经节(TG)感觉神经元的表达以及IgE-IC通过激活TG感觉神经元引起细胞内钙离子浓度的变化。1、小鼠眼部瘙痒和疼痛行为的区分(1)使用致痛剂滴眼并观察小鼠眼部的疼痛相关行为。(2)使用致痒剂滴眼并观察小鼠眼部的瘙痒相关行为。2、建立小鼠过敏性眼部瘙痒模型及瘙痒相关行为的测定(1)滴加致敏原到过敏小鼠眼部,建立眼部瘙痒模型。(2)提前给予过敏小鼠组胺H1受体拮抗剂或肥大细胞稳定剂后再用致敏原激发,测定激发后眼部痒觉行为。(3)提前过敏小鼠眼部给予Anti-FcεRIα抗体后再给予致敏原激发,测定激发后眼部痒觉行为。3、应用免疫组织荧光、实时定量PCR (qPCR)和Western Blotting检测FcεRI和FcεRII在小鼠TG感觉神经元的表达。4、分离培养C57BL/6小鼠TG神经元,用钙离子成像技术检测不同浓度IgE-IC对TG神经元细胞内钙离子浓度的影响。结果1、疼痛和瘙痒刺激分别在小鼠眼部引起不同的反射行为。致痛剂(5 μM Capsaicin)引起小鼠前爪在眼部明显增加的拂扫(wiping)行为,而致痒剂(10μM BAM8-22)引起小鼠后爪在眼部明显增加的搔抓(scratching)行为。2、致敏原激发小鼠眼部过敏,引起过敏小鼠产生肥大细胞和组胺非依赖性的痒搔抓行为。(1)0.1%、1%、5% OVA溶液在过敏小鼠眼部引起浓度依赖性的搔抓(痒觉相关)行为。(2) 小鼠眼部过敏性瘙痒不能被肥大细胞稳定剂和组胺H1受体拮抗剂所完全抑制。(3)在过敏性小鼠眼部滴加Anti-FcεRIα抗体能明显抑制致敏原引起的眼部瘙痒。3、FcSRI的α、β、γ三个亚基都在离体培养的TG神经元细胞上有表达。4、Fc8RI在过敏性小鼠TG神经元上表达增加(1)过敏组TG神经元表达的FcsRIp和p亚基蛋白水平明显高于Naive(正常对照)组和OVA(非致敏)组小鼠TG神经元。(2) FcsRIp亚基在小鼠TG的MrgprD+神经元、MrgprA3+(痒觉特异性)神经元上表达并在TG部分肽能神经元和非肽能神经元上有表达。(3)过敏组小鼠TG神经元表达的Fc8RI7亚基蛋白水平无明显变化。5、IgE-IC激活离体培养的TG神经元(1) IgE-IC细胞外给药可引起正常和过敏小鼠TG小神经元细胞内钙离子浓度增加,且具有剂量-反应强度依赖性。(2)与对照组比较,应用FcεRⅠα siRNA使离体培养的TG神经元FcεRIα亚基表达降低。(3)与对照组比较,IgE-IC细胞外给药激活siRNA组神经元的比例明显降低且引起的细胞内钙离子浓度增加幅度也明显降低。6、IgE低亲和力受体FcεRⅡ (CD23)在过敏性眼部瘙痒小鼠的TG神经元上表达下降。结论我们的研究结果表明：(1)小鼠TG感觉神经元表达功能性的FcεRI和FcεRII。(2)IgE-IC通过FcεRIa激活TG感觉神经元,引起细胞内钙增加。(3)过敏性眼部瘙痒小鼠TG感觉神经元FcεRI表达增加,提高了TG感觉神经元对IgE-IC的敏感度。(4)外周感觉神经元FcεRⅠ被IgE-IC激活可能直接参与了组胺非依赖性过敏性瘙痒的产生。(5)TG神经元FcεRI和FcεRⅡ表达的失调可能参与小鼠眼部的过敏性瘙痒。临床意义本项研究在小鼠过敏性眼结膜瘙痒模型上揭示了一个全新的关于过敏性瘙痒的机制：IgE免疫复合物直接作用于外周感觉神经元的Fc8RI而导致痒觉和瘙痒症的发生。此机制的阐明可能为过敏性瘙痒的治疗提供了一个全新的思路和靶点。