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背景最新研究指出原发性肝癌因高发病率、高死亡率(恶性肿瘤发病率中男性居第五、女性居第七,死亡率中男性居第二、女性居第六),己然倍受全球瞩目。即便手术切除、介入栓塞、伽玛射线、射频消融、肝移植等治疗技术日益完善,一旦评定为晚期肝癌,其中位生存时间仅6-8个月。因此,如何预防肝癌的复发及转移,从而提高肝癌患者生存率,是目前研究的主要方向。本课题组在既往研究成果基础上,首次提出：肝癌高复发及转移率的主要原因是“肝癌余毒未清”的假说,认为一方面肝癌形成的主要危险因素包括肝炎病毒、黄曲霉素、有机氯化合物、藻类毒素等未得到有效控制,另一方面,适宜肝癌术后复发、转移的肿瘤微环境持续存在。因此,如何持续清除“肝癌余毒”可能成为预防肝癌复发、转移的主要路径。蟾酥制剂具有“祛湿化瘀、清热解毒”功效,提取物蟾毒灵(bufalin)的近期研究成果均被证实其可抑制肝癌细胞株的增殖、侵袭、迁移,其中体外实验机制针对AKT靶点,影响AKT/GSK3β/β-catenin/E-cadherin信号通路相应因子,并且结合肿瘤微环境的角度,已证实其具备抑制多种恶性肿瘤细胞株侵袭及迁移的能力,逐步成为国内、外研究焦点问题。原发性肝癌具有器官倾向性,所以建立单克隆人肝癌细胞株肺靶向转移裸鼠模型,运用bufalin验证之前体外实验机制,进一步确定有效的体内治疗方法势在必行。目的本研究从体内实验观察bufalin对裸鼠人肝癌细胞株肝原位移植瘤的生长、肝癌组织坏死及细胞凋亡、肺转移灶形成的影响,并以AKT作为靶点,进一步深入探讨其对肝原位移植瘤AKT/GSK3β/β-catenin/E-cadherin信号通路相关蛋白的变化趋势及相关现象产生的机理。方法建立荧光高转移肝癌细胞株HCCLM3-R和相应裸鼠模型的基础上,随机分组符合造模标准的人肝癌细胞株肝原位移植瘤裸鼠,运用生理盐水(NS)为阴性对照组、1 mg/kg bufalin (BF1)治疗组、1.5 mg/kg bufalin (BF2)治疗组以及LY294002 (LY)治疗组为阳性对照组腹腔注射治疗4周后,于第39天处死各组裸鼠。通过测算裸鼠肝原位移植瘤重量、肝移植瘤体积、抑瘤率评价bufalin对人肝癌细胞株肝原位移植瘤生长的影响；行HE常规病理染色观察肝原位移植瘤坏死程度、TUNEL荧光染色标记肝原位移植瘤凋亡数目,评价bufalin对肝原位移植瘤组织坏死及细胞凋亡的影响：荧光体视显微镜下观察肺转移灶面积、HE常规病理染色测算肺转移灶数目,评价bufalin对肺靶向转移的影响；行免疫组化实验及Western bolt检测,评价bufalin对肝原位移植瘤组织中与AKT/GSK3 β/β-catenin/E-cadherin信号通路相关蛋白表达量的影响及变化趋势。结果1.bufalin对裸鼠人肝癌细胞株肝原位移植瘤生长的影响测算得生理盐水(NS)阴性对照组、1 mg/kg bufalin (BF1)治疗组、1.5 mg/kg bufalin (BF2)治疗组以及LY294002 (LY)阳性对照组的裸鼠肝原位移植瘤重量分别为1.93±0.45 g、1.65±0.60 g、1.10±0.23 g、0.76±0.23g,体积分别为1379.75±741.48 mm3、1174.69±692.42 mm3、712.88±212.12 mm3、438.35± 303.37mm3;其中1 mg/kg bufalin (BF1)治疗组、1.5 mg/kg bufalin (BF2)抑瘤率分别为13.51±1.35%、46.27±2.06%,LY294002(LY)治疗组抑瘤率为66.84±1.40%。bufalin治疗组较NS组相比,1.5 mg/kg bufalin (BF1)治疗组均有统计学意义(分别为P<0.01、P<0.05、P<0.01),与LY294002 (LY)阳性对照组相仿,而lmg/kg bufalin (BF1)仅抑瘤率改变有统计学意义(P<0.05)。2.bufalin对裸鼠肝原位移植瘤组织坏死及细胞凋亡的影响其一,将生理盐水(NS)阴性对照组、1 mg/kg bufalin (BF1)治疗组、1.5mg/kg bufalin (BF2)治疗组以及LY294002 (LY)阳性对照组的裸鼠肝原位移植瘤HE染色作常规病理检查,各组癌灶内均存在坏死灶,细胞核多溶解,胞质呈嗜酸性染色,坏死主要集中在肿瘤中央部位,而肝癌细胞在癌灶边缘生长仍较为活跃,四组坏死程度依次为仅部分轻度坏死、中度坏死、重度坏死、重度坏死。其二,将生理盐水(NS)阴性对照组、1 mg/kg bufalin (BF1)治疗组、1.5mg/kg bufalin (BF2)治疗组以及LY294002 (LY)阳性对照组的裸鼠肝原位移植瘤作TUNEL荧光染色标记凋亡数目,每400倍视野内四组分别含凋亡细胞63.20±10.33个、106.20±7.12个、146.80±14.20个、106.20±-7.12个,两剂量bufalin治疗组较NS阴性对照组有统计学差异(P<0.01),且结果与LY294002(LY)阳性对照组相仿。3.bufalin对裸鼠肺靶向转移的影响580nm激发光荧光体视显微镜下观察生理盐水(NS)阴性对照组、1 mg/kg bufalin (BF1)治疗组、1.5 mg/kg bufalin (BF2)治疗组以及LY294002 (LY)阳性对照组的裸鼠肺转移灶,其转移灶荧光斑点面积分别为17937.33±3997.06pixels、2217.00±475.07 pixels、512.00±95.83 pixels、356.50±83.29 pixels。进一步行肺部连续切片HE染色作常规病理检查,各组肺泡间质内均存在肿瘤细胞,其聚集成团,异型性明显,胞核淡染,但转移灶细胞数各不相同,依次为112.17±19.05个/肺、68.17±9.47个/肺、39.67±±3.72个/肺、36.33±5.99个/肺。荧光定量与HE染色结果相符,均提示bufalin两剂量治疗组较NS阴性对照组有统计学差异(P<0.01),且1.5mg/kg bufalin (BF2)治疗组结果同LY294002 (LY)阳性对照组相仿。4.免疫组化检测bufalin对裸鼠模型肝原位移植瘤组织中与AKT/GSK3β/β-catenin/E-cadherin信号通路相关蛋白表达量的影响及变化趋势观测生理盐水(NS)阴性对照组、1 mg/kg bufalin (BF1)治疗组、1.5mg/kg bufalin (BF2)治疗组以及LY294002 (LY)阳性对照组的裸鼠肝原位移植瘤细胞核、细胞浆及细胞膜阳性细胞百分数和染色强度,同时通过软件分析,记录平均吸光密度(average optical density,AOD)作免疫组化半定量评价,示：pAKT、 pGSK3β、β-catenin、MMP2、MMP9蛋白均有表达,且四组指数呈递减趋势；GSK30仅生理盐水(NS)阴性对照组呈阴性表达,余组表达阳性且呈递增趋势；E-cadherin在生理盐水(NS)阴性对照组、1 mg/kg bufalin (BF1)治疗组中呈阴性表达,余组表达阳性；四组AKT均呈阴性表达。观察数据AKT/GSK3β/β-catenin/E-cadherin信号通路相关的蛋白表达量并做统计研究,得出其均与bufalin处理因素及剂量高低相关,且与生理盐水(NS)阴性对照组相比,bufalin两剂量的变化趋势与LY294002 (LY)阳性对照组相仿。5.Western blot检测bufalin对裸鼠模型肝原位移植瘤组织中与AKT/GSK3β/β-catenin/E-cadherin信号通路相关的蛋白表达量的影响及变化趋势Western blot分析生理盐水(NS)阴性对照组、1 mg/kg bufalin (BF1)治疗组、1.5 mg/kg bufalin (BF2)治疗组以及LY294002 (LY)阳性对照组的裸鼠肝原位移植瘤,各组pAKT、pGSK3β、β-catenin、MMP2、MMP9蛋白表达量逐级下调,各组GSK3β、E-cadherin蛋白表达量逐级上升,各组AKT蛋白表达量基本不变。观察数据AKT/GSK3β/β-catenin/E-cadherin信号通路相关的蛋白表达量并做统计研究,其均与bufalin处理因素及剂量高低相关,且与生理盐水(NS)阴性对照组相比,bufalin两剂量的变化趋势与LY294002 (LY)阳性对照组相仿。结论1.bufalin可以抑制裸鼠人肝癌细胞株肝原位移植瘤生长,使裸鼠肝原位移植瘤重量减轻、肝移植瘤体积减小、增加抑瘤率。2.bufalin可以诱导裸鼠人肝癌细胞株肝原位移植组织坏死及细胞凋亡,使肝原位移植瘤坏死程度加剧、凋亡数目增多。3.bufalin可以抑制裸鼠肺靶向转移形成,减少肺转移灶形成的面积及数目。4.bufalin作用于AKT/GSK3 β/β-catenin/E-cadherin信号通路相关,抑制裸鼠人肝癌细胞株肝原位移植瘤的生长,诱导肝癌组织坏死及细胞凋亡,减少肺靶向转移的形成。