血管性认知障碍（vascular cognitive impairment,VCI）是指由脑血管病或脑血管病危险因素所引起的从轻度认知障碍至痴呆的一大类综合征。随着人口老龄化的加剧,VCI发病率逐年攀升,认知障碍严重影响了患者日常生活以及社会功能,给家庭及社会带来沉重的负担,因此针对本病机制的研究以及临床如何早期预测,早期干预成为目前国内外研究的热点。大量临床及实验室数据表明缺血性脑白质病变（white matter lesions,WMLs）参与促进了认知障碍的发生发展,与执行功能降低、信息处理速度下降以及全面性的认知功能减退有关。关于WMLs与VCI之间的关系,部分临床研究未得出统一的结论,这可能与入组人群、白质评估方法等差异有关。然而大量实验室研究却一致认为,WMLs参与促进了VCI的发展,并且,针对减轻WMLs的治疗策略有助于VCI认知功能的恢复。AMP-活化的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）/沉默交配型信息调控2同源物（silent mating type information regulation 2homologue 1,SIRT1）通路广泛参与抑制炎症反应以及防止髓鞘脱失的过程,然而其在VCI模型中的作用尚未见研究。信号传导与转录激活因子-3（signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）以及核因子-κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）是经典的促炎因子,参与髓鞘脱失、轴索损伤、炎症级联反应等等,并且研究证实,STAT3/NF-κB通路的活性可受SIRT1调控,然而在VCI的病理变化中,AMPK/SIRT1通路与STAT3/NF-κB通路之间是否存在互相调节作用,尚无研究。丁苯酞（DL-3-n-butylphthalide,NBP）是目前临床上急性缺血性卒中领域广泛应用的药物,在许多临床及动物实验中都被证实能够改善VCI。NBP对认知功能的保护机制尚未完全明确,是否与减轻WMLs有关,是否与调节AMPK/SIRT1通路与STAT3/NF-κB通路有关,相关报道较少。基于上述背景,本研究选择以WMLs为典型表现的皮质下缺血性脑血管病（subcortical ischemic vascular disease,SIVD）患者以及正常对照组（normal control,NC）人群进行病例对照研究,探索WMLs与血管性认知功能损害的关系;进一步通过在Sprague‐Dawley（SD）大鼠上进行双侧颈总动脉结扎术（bilateral common carotid artery occlusion,BCCAO）来模拟VCI中的WMLs,探索NBP对血管性痴呆大鼠的认知保护作用及其机制,为临床研究VCI治疗策略提供新的思路。第一部分皮质下缺血性脑血管病脑白质病变与认知障碍的关系目的:通过应用系列神经心理测试量表分析皮质下VCI患者的认知功能,并应用计算机图像分割定量软件测量其WMLs体积,探讨SIVD患者WMLs与认知障碍的关系。方法:根据Erkinjuntti提出的头颅磁共振成像（magnetic resonance imaging,MRI）诊断标准纳入SIVD患者62例,依据VCI诊断标准分为血管性痴呆（vascular dementia,Va D）组30例,血管性认知障碍非痴呆（vascular cognitive impairment no dementia,VCIND）组32例,纳入性别、年龄匹配的正常对照组（normal control,NC）25例。由经过专业培训的医师记录受试者的性别、年龄、受教育年限,并进行简明精神状态检查（mini-mental status examination,MMSE）、蒙特利尔认知评估量表北京版（Montreal cognitive assessment,Mo CA）以及针对记忆力、执行功能、视空间、语言、注意力的5个认知亚项的系列神经心理学测试,记录受试者各认知域的量表分数。行头颅MRI扫描,应用3D-slicer软件分别测量额叶、顶枕区、颞叶、幕下、基底节区的WMLs体积,并总和为WMLs总体积,应用相关性分析和分层多元线性回归分析探讨SIVD认知障碍的特点以及WMLs体积与SIVD认知功能损害之间的关系。结果:1.Va D、VCIND、NC三组之间在年龄、性别、受教育年限上均无统计学差异（P>0.05）。Va D组的WMLs总体积以及各区域WMLs体积均显著性高于NC组。并且Va D组的WMLs总体积,额叶、顶枕、颞叶WMLs体积高于VCIND组（P<0.05）;2.相较于NC组,Va D组的听觉词语学习测验（auditory verbal learning test,AVLT）-即刻回忆、延迟回忆与再认评分均显著性降低（P<0.05）;VCIND组的AVLT-延迟回忆评分明显降低（P<0.05）。Va D组各项评分分值明显低于VCIND组（P<0.05）;3.与NC组相比,Va D和VCIND组的Stroop色词测验（Stroop color words test,CWT）、连线测验-b（trail making test-b,TMT-b）用时均显著延长,差异具有统计学意义（P<0.05）。并且除CWT-a、TMT-b以外,Va D组各项测试用时均长于VCIND组（P<0.05）;4.Va D组较VCIND组和NC组画钟测验（clock drawing test,CDT）分数显著减少（P<0.05）。VCIND组较NC组分数减少,差异有统计学意义（P<0.05）;5.Va D组较VCIND组和NC组数字广度测验（digit span test,DST）分数显著性减少,连线测验-a（trail making test-a,TMT-a）用时显著延长,（P<0.05）。VCIND组较NC组DST分数减少,TMT-a用时延长,差异有统计学意义（P<0.05）;6.Va D组较VCIND组和NC组词语流畅性测验（verbal fluency test,VFT）分数显著性减少（P<0.05）。VCIND组与NC组分数无统计学差异（P>0.05）;7.相关性分析结果显示WMLs总体积与MMSE、Mo CA、AVLT、CDT、VFT、DST评分呈显著负相关（P<0.05）;与CWT、TMT评分呈正相关（P<0.05）;额叶WMLs体积与CWT-a、CWT-b、CWT-c、TMT-b评分呈正相关（P<0.05）;8.分层多元线性回归分析,在校正年龄、性别与受教育年限的影响后,WMLs总体积能解释各量表评分改变的8.1-31.2%（P<0.05）;额叶WMLs体积能解释执行功能相关量表评分的7.1-17.9%（P<0.05）。小结:1.SIVD患者存在明显而广泛的认知损害,以执行功能、视空间和注意力受损较为突出,同时伴随着各脑叶WMLs体积的增多;2.SIVD患者的WMLs以额叶、顶枕区较为严重。全脑WMLs总体积与总体认知功能、记忆、执行、视空间、语言以及注意力明显相关,随着WMLs总体积的增加,SIVD患者认知损害加重;3.校正年龄、性别和受教育年限后,WMLs总体积可以解释认知损害变化的8.1-31.2%,并且对记忆、执行功能改变的评价效力相对较高;额叶WMLs体积能解释执行功能各量表评分的7.1-17.9%。第二部分丁苯酞对血管性痴呆大鼠空间学习记忆能力的改善作用目的:利用BCCAO手术在SD大鼠中模拟VCI病人的慢性颅脑低灌注（chronic cerebral hypoperfusion,CCH）状态,给予60mg/kg、120mg/kg NBP灌胃,于术后4周应用Morris水迷宫测试各组大鼠的学习及记忆能力,并进一步应用HE染色在光学显微镜下观察各组大鼠海马的组织学完整性。探讨NBP对VD大鼠空间学习记忆能力的改善作用。方法:3月龄雄性SD大鼠36只,从中随机选取9只作为假手术组（Sham组）给与假手术以及术后安慰剂灌胃。其余27只经历BCCAO术后随机平均分为模型组（Model组）、低剂量组(NBP60组)和高剂量组(NBP120),并给与安慰剂或者相应浓度的NBP灌胃,共干预4周。于术后23天进行Morris水迷宫实验。水迷宫测试分为两部分:1)定位航行实验（place navigation test）:连续5天,每天训练4次,记录各组大鼠的逃避潜伏期（escape latency）,用来评估大鼠的空间学习能力;2)空间探索实验（spatial probe test）:实验的第6天,撤去平台,记录大鼠在120s内穿越原平台坐标的次数以及在平台象限停留的时间占总游泳时间的百分比,用以反映大鼠的空间记忆能力。水迷宫测试结束后,将大鼠灌注固定并石蜡包埋脑组织,采用HE染色观察大鼠海马结构的完整性。结果:Morris水迷宫定位航行实验阶段,随训练天数增加,各组大鼠逃避潜伏期逐渐缩短;第3-5天,相较于Sham组,Model组逃避潜伏期明显延长（第3天:P<0.05;第4天:P<0.01;第5天:P<0.001）。而NBP的治疗能够在第3-5天有效缩短逃避潜伏期(第3天:P<0.05 NBP120组vs.Model组;第4天:P<0.05 NBP60组vs.Model组,P<0.01 NBP120组vs.Model组;第5天:P<0.05 NBP60组vs.Model组,P<0.01 NBP120组vs.Model组);在空间探索实验阶段,对比Sham组大鼠,Model组大鼠在目标象限停留的时间缩短,并且穿越次数明显减少（所有P<0.001）。而NBP治疗后的VD大鼠穿越平台次数及目标象限停留时间均较Model组增多(所有P<0.05,NBP60组vs.Model组,所有P<0.001,NBP120组vs.Model组);HE染色观察海马CA1区,Sham组海马CA1区的神经元着色均匀,细胞形态正常,核仁清晰,Model组大鼠海马CA1区神经元数量明显减少,排列疏松,形态不规则,胞核固缩,核仁消失。NBP治疗组大鼠海马CA1区神经元丢失减少,细胞排列较紧密均匀,胞核固缩明显减少,以NBP120组改善最明显。小结:1.本实验采用BCCAO的方法在SD大鼠上模拟了VD的病理过程。该模型稳定、有效,为探索临床药物疗效和机制提供了基础;2.NBP能够减轻CCH诱导的认知功能下降,同时减轻海马结构的破坏。提示NBP对VD大鼠的认知功能以及海马神经元均有保护作用。第三部分丁苯酞对血管性痴呆大鼠胼胝体的髓鞘再生促进作用以及胶质增生抑制作用目的:建立模型后给予相应干预以及5-溴脱氧尿苷（5-bromodeoxyuridine,Brd U）注射。于术后2周、4周分别取材,进行固蓝（Luxol fast blue,LFB）染色,少突胶质细胞谱系转录因子2（oligodendrocyte lineage transcription factor 2,Olig2）/Brd U、神经胶质酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）/Brd U免疫荧光双标,以及髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein,MBP）、Olig2的蛋白及核酸测定,探讨NBP对VD大鼠胼胝体的促进髓鞘再生作用与抑制胶质增生作用。方法:选取72只SD大鼠,如上述随机分为4组,并给予安慰剂或相应浓度的NBP灌胃。每组选取6只自术后第二天开始,连续腹腔注射Brd U（50 mg/kg,1/日）14天。各组大鼠平均分为2部分,分别于术后2周、术后4周处死取材。注射过Brd U的大鼠经灌注固定后处死,石蜡包埋脑组织切片,进行LFB染色、Olig2/Brd U、GFAP/Brd U免疫荧光双标;未注射Brd U的大鼠处死取以胼胝体为主的脑白质,应用实时荧光定量PCR（quantitative Real-Time PCR,q RT-PCR）法和Western blot法检测各组MBP、Olig2的表达。结果:1.术后2周,对比Sham组,Model组大鼠出现明显的髓鞘脱失（P<0.001,LFB染色）,伴随着MBP蛋白及核酸水平的下降（所有P<0.001）。NBP的治疗能够明显减轻髓鞘脱失(LFB染色:所有P<0.001,NBP60组或者NBP120组vs.Model组;MBP m RNA水平:P<0.05,NBP60组vs.Model组,P<0.001,NBP120组vs.Model组;MBP蛋白水平:P<0.05,NBP120组vs.Model组)。术后4周,Model组大鼠髓鞘密度、MBP m RNA水平、MBP蛋白水平均下降（所有P<0.001）,且较2周时更加严重。而NBP治疗组表现出较少的髓鞘脱失以及较高的MBP表达水平(LFB染色:所有P<0.001,NBP60组或者NBP120组vs.Model组;MBP m RNA水平:P<0.01,NBP60组vs.Model组,P<0.001,NBP120组vs.Model组;MBP蛋白水平:P<0.05,NBP60组vs.Model组,P<0.001,NBP120组vs.Model组);2.CCH会造成大鼠胼胝体中Olig2阳性细胞计数的持续性减少（所有P<0.001,Model组2周以及4周vs.Sham组;P<0.05,Model组2周vs.Model组4周）,对比Model组,NBP120组大鼠在术后2周、4周都展现出更多的Olig2阳性细胞（2周:P<0.05;4周:P<0.001）;3.对比Model组,NBP的治疗明显增加胼胝体Olig2+/Brd U+细胞的计数(术后2周、4周:所有P<0.001,NBP60组或者NBP120组vs.Model组);4.术后2周及4周,对比Sham组,Model组大鼠的Olig2蛋白及核酸水平均明显降低（Olig2蛋白水平:P<0.01;Olig2 m RNA水平:P<0.001）,而NBP120组大鼠比Model组大鼠表现出更高水平的Olig2蛋白以及核酸水平（2周:Olig2蛋白水平:P<0.05;Olig2 m RNA水平:P<0.001;4周:Olig2蛋白水平:P<0.01;Olig2 m RNA水平:P<0.05）;5.术后2周及4周,对比Sham组,Model组大鼠胼胝体内出现大量GFAP+/Brd U+双阳性细胞（术后2周:P<0.05;术后4周:P<0.001）,NBP的治疗能够有效抑制星形胶质细胞增生(术后2周:P<0.01 NBP60组vs.Model组,P<0.001 NBP120组vs.Model组;术后4周:所有P<0.001NBP60组,NBP120组vs.Model组)。小结:1.CCH诱导的VD大鼠模型中,胼胝体髓鞘密度下降,脑白质内MBP表达减少,较成功地模拟出VD中WMLs,伴随大鼠学习、记忆能力下降,提示VD大鼠脑白质脱髓鞘造成认知功能的下降。而NBP的干预能够保护髓鞘完整性从而改善认知功能下降;2.CCH诱导的VD大鼠胼胝体中,Olig2阳性细胞计数减少。而NBP能够促进VD大鼠胼胝体内少突胶质细胞新生、脑白质内Olig2表达,从而促进髓鞘修复,发挥认知保护作用;3.CCH诱导的VD大鼠模型中,星形胶质细胞大量增殖,伴随少突胶质细胞减少、髓鞘密度下降、认知功能减退,而NBP的治疗能够有效抑制星形胶质细胞增殖,保护少突胶质细胞与髓鞘,从而发挥神经保护作用。第四部分丁苯酞对血管性痴呆大鼠髓鞘再生促进作用以及胶质增生抑制作用的机制目的:依照第三部分造模及分组干预,通过检测各组大鼠BCCAO术后2周、4周脑白质组织中的AMPK/SIRT1通路以及STAT3/NF-κB通路的表达情况,探索VD模型中这两条通路的变化趋势以及NBP对这两条通路的调节情况。方法:按照第三部分建立模型以及分组给予安慰剂或相应浓度的NBP,每组大鼠分别于术后2周、4周处死取材,采用Western blot法检测各组p-AMPK、SIRT1、p-STAT3、TNF-α总蛋白以及NF-κB-p65核蛋白水平;q RT-PCR法检测各组SIRT1、TNF-α的m RNA水平。结果:1.术后2周,Model组大鼠脑白质炎症因子水平明显升高（TNF-α:蛋白水平P<0.05,m RNA水平P<0.01;p-STAT3以及NF-κB-p65蛋白水平:所有P<0.001）,而NBP能够有效抑制炎症反应(TNF-α:蛋白及m RNA水平:所有P<0.05;p-STAT3以及NF-κB-p65蛋白水平:所有P<0.001,NBP120组vs.Model组,所有P<0.01,NBP60组vs.Model组);术后4周,Model组炎症因子水平仍高于Sham组（TNF-α:蛋白水平P<0.01,m RNA水平P<0.001;p-STAT3以及NF-κB-p65蛋白水平:所有P<0.001）,且明显高于术后2周（p-STAT3和NF-κB-p65蛋白水平:所有P<0.05;TNF-αm RNA:P<0.001）,而NBP依然能有效抑制炎症反应(TNF-α:蛋白水平P<0.05,m RNA水平P<0.001;p-STAT3以及NF-κB-p65蛋白水平:所有P<0.001,NBP120组vs.Model组);2.术后2周,VD大鼠脑白质内p-AMPK、SIRT1水平明显降低（p-AMPK蛋白水平:P<0.001;SIRT1蛋白及m RNA水平:所有P<0.01）,NBP能够部分逆转AMPK/SIRT1通路的下调(p-AMPK蛋白水平:P<0.01;SIRT1:蛋白水平P<0.05,m RNA水平P<0.01,NBP120组vs.Model组)。术后4周,Model组呈现更严重的AMPK/SIRT1通路下调（p-AMPK蛋白水平:P<0.001;SIRT1:蛋白水平P<0.05,m RNA水平P<0.001）,NBP上调VD大鼠的AMPK/SIRT1通路水平(p-AMPK蛋白水平:P<0.001;SIRT1蛋白水平:P<0.01;SIRT1 m RNA水平:P<0.001,NBP120组vs.Model组)。小结:1.CCH诱导的VD大鼠模型中,p-STAT3、NF-κB-p65以及TNF-α明显增多,伴随着少突胶质细胞减少、髓鞘脱失。提示炎性反应参与CCH诱导的WMLs。而NBP的干预能够有效抑制上述促炎因子,提示NBP的髓鞘保护作用与抑制此炎症通路有关;2.CCH诱导的VD大鼠模型中,p-AMPK、SIRT1表达明显降低,而NBP的治疗能够激活AMPK/SIRT1通路,提示NBP对于认知、髓鞘的保护作用与上调AMPK/SIRT1通路有关;3.AMPK/SIRT1与STAT3/NF-κB通路之间在VD大鼠模型中存在交互作用,在实验各组大鼠中,AMPK/SIRT1信号通路与STAT3/NF-κB信号通路呈现明显相反的趋势,而NBP可能作为两条通路之间的调节剂发挥作用。