血管性痴呆（vascular dementia,VaD）是继阿尔茨海默症之后的世界第二大痴呆,给人们的日常生活和经济带来沉重负担。VaD是指血管的危险因素和/或血管原因相关的认知障碍,包括从轻度认知障碍到痴呆的整个过程。病 因 包 括 慢 性 脑低灌注、关键部位的梗死、多发的脑梗死、微梗死、微出血、脑白质病变、CADASIL、脑淀粉样病变,进而导致了个体的认知障碍。其中双侧颈动脉结扎所致的慢性脑低灌注（CCH）被认为是VaD的理想模型。这种较为经典的模型是否可以很好的模拟临床上的VaD患者的发病过程,本研究将临床病例与动物模型进行进一步探讨。CCH可引起一系列病理生理事件,包括炎症,氧化应激等。神经炎症在清除病原体和吞噬凋亡细胞、碎片的过程中起重要作用。然而,不受控制或慢性的神经炎症通过产生神经毒性介质和促炎细胞因子而发挥神经毒性作用。神经炎症与认知功能密切相关。神经炎症因子的释放可以激活免疫系统细胞,并参与调节神经发生,突触可塑性和神经元存活从而影响学习和记忆的形成。星形细胞是中枢神经系统中最丰富的细胞,占脑细胞总数的40%。GFAP是星形胶质细胞标记物,是最广泛使用的标记物,用于检查神经损伤,变形和发炎。当机体早期暴露于与压力后,星形胶质细胞的形态和瞬态会发生永久性变化。NLRP3炎性体是目前研究最广泛的炎症小体。各种因素都可能触发这种炎性小体,例如病原体相关分子模式（PAMP）和损伤相关分子模式（DAMP）。因此,进一步推断若有药物可以选择性抑制上述过程的分子或基因将在VaD的治疗中具有巨大的治疗意义。或者任何可以引起神经炎症的手段是否都可以导致认知障碍,这是否可以更好地模拟出血管性痴呆的发病过程。因此本研究分为5个部分,第一部分收集临床病例,观察不同个数的无症状颈动脉狭窄和/或椎动脉狭窄患者的认知功能;第二部分建立单侧颈动脉结扎、双侧颈动脉结扎的动物模型验证是否与第一部分的临床结果相符,进一步探讨2VO模型的合理性;第三部分2VO方法建立血管性痴呆模型,予以模型动物鼻饲黄芪甲苷（高、低剂量组）,观察应用黄芪甲苷后,动物的认知水平是否有改善;第四部分检测第三部分的动物的S OD、MDA含量,并分析PGC1α/Nrf2、Sting/NLRP3/caspase1通路蛋白的变化,探讨其中可能的连接机制。第五部分创新性的应用香烟烟雾暴露方法联合2VO方法进行模型制作,研究戒烟后是否仍旧存在神经炎症,影响认知功能。本论文应用了Morris水迷宫（MWM）进行行为学评测,酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）及蛋白质免疫印迹（Western blot,WB）、免疫荧光（Immunofluorescence,IF）等技术,从功能学、形态学、蛋白表达等方面观察神经炎症对VaD大鼠认知功能的影响,探讨其作用机制。第一部分无症状颈动脉狭窄、椎动脉狭窄患者的认知功能的临床研究目的:观察严重无症状颈动脉狭窄、椎动脉狭窄患者的认知功能。方法:本实验选取河北省人民医院神经内科2019年1月至2020年12月于河北省人民医院神经内科住院并且完成认知功能检测的无症状的单侧颈动脉狭窄（狭窄率70%-99%,9例）、双侧颈动脉狭窄（一侧狭窄率70%-99%,另一侧狭窄率大于50%,9例）、单侧颈动脉+单侧椎动脉狭窄（2只血管狭窄率均为70%-99%,8例）。入选患者均已签署知情同意书。患者入组后临床资料收集表,主要包括性别、年龄。并收集其蒙特利尔认知评估量表（Montreal cognitive assessment,MoCA）评估结果。结果:1.颈部血管狭窄得个数与认知障碍呈现正相关。2.各组之间的年龄差异无统计学意义。3.单侧颈动脉狭窄的患者与双侧颈动脉狭窄患者的认知比较无统计学意义,但是与单侧颈动脉+单侧椎动脉狭窄组的患者认知比较,具有统计学差异（P<0.05）。小结:认知功能障碍程度与颈部动脉狭窄程度以及个数是相关的。单侧颈动脉狭窄+单侧椎动脉狭窄组患者的认知功能是最差的。第二部分单侧颈动脉狭窄与双侧颈动脉狭窄大鼠认知功能的比较目的:观察单侧颈动脉狭窄与双侧颈动脉狭窄大鼠的认知功能方法:选取清洁级健康雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠共 18 只（3月龄）,体重 200-250g,适应性饲养1周后,将大鼠随机分为3组,每组6只。假手术组（sham group）,单侧颈动脉闭塞组（1 VO group组）,双侧颈动脉闭塞组（2VO group）。后正常饲养4周后,应用Morris水迷宫自动记录仪进行为期6天的行为学测试。前5天为定位航行实验,最后一天为空间探索实验。结果:1定位航行实验1.1与sham组相比,1VO组逃避潜伏期无明显差异。1.2与sham组相比,2VO组的逃避潜伏期是延长的（Day1:P<0.05;Day2-5:P<0.01）。1.3与 2VO组相比,1VO组的逃避潜伏期是缩短的（Day2-3:P<0.01;Day4-5:P<0.05）。2空间探索实验2.1与sham组跟1VO组相比,2VO组在目标象限停留得时间显著缩短（P<0.01）2.2 1VO组与sham组相比,在目标象限停留得时间无显著差异。小结:2VO法是较为理想的制备VaD的模型。第三部分黄芪甲苷可减轻血管性痴呆模型大鼠的认知障碍目的:黄芪甲苷对血管性痴呆模型大鼠的认知保护作用。方法:选取清洁级健康雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠共40 只（3月龄）,体重200-250g,适应性饲养1周后,将大鼠随机分为4组,每组10只。假手术组（sham group）,模型组（2VO group）,黄芪甲苷低剂量（As-IV20 group）,和黄芪甲苷高剂量（As-IV50 group）。应用2VO法制备VaD模型,sham group和2VO group每日给予双蒸水 1-2ml/次,连续4周。As-IV20 group按照每日予以黄芪甲苷20mg/kg进行灌胃,Ast-IV50 group按照每日予以黄芪甲苷50mg/kg进行灌胃,连续4周。应用Morris水迷宫自动记录仪进行为期6天的行为学测试。前5天为定位航行实验,最后一天为空间探索实验。结果:1定位航行实验1.1与sham组相比,从第一天到第五天,2VO组的逃避潜伏期明显长（p<0.01）。1.2与sham组相比,第一天,As-IV50组的逃避潜伏期是缩短的（P<0.05）第二天至第五天五显著差异。1.3与sham组相比,As-IV20组的逃避潜伏期在五天之中无显著差异。1.4与2VO组相比,As-IV50组逃避潜伏期在五天之中是明显缩短的（P<0.01）;As-IV20组的逃避潜伏期也是缩短的（第一天p<0.01;第二天P<0.05;第三天P<0.01;第四天:P<0.05）。1.5与As-IV50组相比,As-IV20组的逃避潜伏期在第一天、第三天、第四天均有差异,As-IV50组表现出较好得结果（P<0.05）。2空间探索试验1.1 2VO组的大鼠在目标象限中花费的时间少于sham组（P<0.01）。1.2 As-IV50、As-IV20组在目标象限花费时间长于2VO组（P<0.01）。小结:根据以上结果,黄芪甲苷具有显著改善由CCH引起的认知障碍的能力,并且大剂量组可以将CCH的认知能力恢复到与假手术组相同的水平。第四部分黄芪甲苷可通过Sting/NLRP3/caspase1途径减少CCH诱导的神经炎症反应目的:观察和探讨神经炎症在VaD发病过程中的作用方法:本部分实验模型制备及分组同第三部分,Western-blot法检测大鼠大鼠海马组织中Sting、NLRP3、caspase1、GFAP、PGC1α、Nrf2的蛋白表达。免疫荧光双标记技术应用于caspase1和GFAP Neun。结果:2VO组的这些炎症因子的表达明显高于sham组（Sting:P<0.01;NLRP:P<0.01;caspase1:P<0.01;GFAP:P<0.01）。As-Ⅳ的应用可以显著缓解这种炎症反应。（Sting:P<0.01,As-Ⅳ20 group vs 2VO group,P<0.01,As-Ⅳ50 group vs 2VO group;NLRP3:P<0.01,As-Ⅳ20 group vs 2VO group,P<0.05,As-Ⅳ50 group vs 2VO group;caspase1:P<0.01,As-Ⅳ20 group vs 2VO group,P<0.01,As-Ⅳ50 group vs 2VO group;GFAP:P<0.01,As-Ⅳ20 vs 2VO组,P<0.01,As-Ⅳ50 vs 2VO group）。检查了神经元和星形胶质细胞中caspase1的表达。在sham组中,在较少的神经元中检测到caspase1。在2VO组中,caspase1的表达主要在神经元中,在星形胶质细胞中很少。与sham组相比,2VO组的GFAPP性细胞数量增加了很多,GFAP表达 显 著上调。在锥体神经元之间和紧密包围的锥体神经区域观察到了GFAP免疫反应性。与sham组相比,2VO组的PGC1α、Nrf2水平降低（PGC1α:P<0.01;Nrf2:P<0.01;）,但是用As-Ⅳ治疗后,这2种因子水平可以恢复（PGC1α:P<0.01,As-Ⅳ20 group vs.2VO group,P<0.01,As-Ⅳ 50 group vs.2VO group;Nrf2:P<0.01,As-Ⅳ20 group vs.2VO group,P<0.01,As-Ⅳ50 group vs.2VO group）。小结:本部分发现黄芪甲苷可以通过上调PGC1α/Nrf2通路而抑制Sting/NLR P3/caspase1通路而发挥抗炎作用,从而改善大鼠海马组织的损害,保护认知功能。第五部分香烟烟雾暴露通过影响神经炎症而加剧血管性痴呆模型大鼠的认知损害目的:香烟烟雾暴露经历可以进一步损害血管性痴呆模型大鼠的认知功能。方法:选取清洁级健康雄性SD大鼠共24只（3月龄）,体重200-250g,适应性饲养1周后,将大鼠随机分为4组。对照组（CT,n=8）,早期烟雾暴露组（ECS,n=6）,血管性痴呆组（2VO,n=7）,早期烟雾暴露+血管性痴呆组（ECS+2VO,n=6）组。本 研 究对ESC,ESC+2VO组进行了为期3个月的香烟烟雾暴露,而后常规饲养1个月后,使用2VO法对2VO,ESC+2VO组进行血管性痴呆模型的制备。4周后使用Morris水迷宫进行行为学测评。Western-blot法检测大鼠大鼠海马组织中NLRP3、caspase1蛋白水平,ELISA检测各组IL1β水平。结果:1定位航行实验1.1 与CT组相比,2VO和ESC+2VO组大鼠的平均时间显着延长第1天到第5天的逃避潜伏期（P<0.05）。1.2与CT组相比,从第1天到第4天ESC组的逃避潜伏期无明显延长,但是第5天,ESC组花费了更多的时间（P<0.05）。1.3 与ESC组相比中,ESC+2VO组的逃避潜伏期从第1天到第5天明显延长（P<0.05）;2VO组从第1天到第4天延长（P<0.05）,第5天2VO与ESC二者的逃避潜伏期无明显差别。1.4从第四天开始,2VO和ESC+2VO组之间的差异才变得越来越明显（第1-3天:P>0.05;第4天:P<0.05;第5天:P<0.01）。2空间探索实验各组大鼠在目标象限停留时间百分比具有明显差异,CT组在目标象限上花费的时间比其他三组多（P<0.05）,但是,ESC组和2VO组相比,大鼠在目标象限中花费的时间没有差异。3 Western-blot结果ESC+2VO组显示与其他三组相比,GFAP有较高的表达（CT:P<0.001;ESC:P<0.001;2VO:P<0.01）。CT组的表达低于ESC组和2VO组（ESC:P<0.01;2VO:P<0.001）。ESC组和2VO组之间没有差异。n=8只大鼠/组（a和b）;ESC+2VO组显示NLRP3的表达高于其他三组（CT:P<0.001;ESC:P<0.01;2VO:P<0.05）。CT组的表达低于ESC和2VO组（ESC:P<0.01;2VO:P<0.001）。ESC和2VO组之间显示无统计学意义。ESC+2VO组的caspase1表达高于其他组三组（CT:P<0.001;ESC:P<0.001;2VO:P<0.01）。2VO组的表达高于CT和ESC组（CT:P<0.01;ESC:P<0.05）。CT和ESC组之间没有区别。4 ELISA结果本研究发现ESC+2VO组的IL1β明显高于其他三组（P<0.001）。CT组的IL1β低于ESC和2VO组中（P<0.01）。但是,ESC和2VO组之间没有区别。小结:1.香烟烟雾暴露可以导致认知障碍,戒烟后不会完全消退,并且吸烟会加重CCH引起的认知障碍。2.香烟烟雾暴露和CCH都通过NLRP3/caspase1/IL1β途径产生神经炎症进而导致认知障碍。