【摘 要】
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目的:探究卡他莫拉菌重要克隆复合群的分子背景;阐明不同耐药表型卡他莫拉菌的致病力;探讨卡他莫拉菌黏附与侵入A549肺泡上皮细胞的可能机制。方法:（1）基于MALDI-TOF MS鉴定、体外药敏、MLST分型测定,筛选出涵盖CC363、CC449、CC224和CC446 4个克隆复合群的70株临床分离株。针对筛选出的70株待测菌株,分别对其进行PFGE分型、copB分型、16S rRNA分型、LOS
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目的:探究卡他莫拉菌重要克隆复合群的分子背景;阐明不同耐药表型卡他莫拉菌的致病力;探讨卡他莫拉菌黏附与侵入A549肺泡上皮细胞的可能机制。方法:（1）基于MALDI-TOF MS鉴定、体外药敏、MLST分型测定,筛选出涵盖CC363、CC449、CC224和CC446 4个克隆复合群的70株临床分离株。针对筛选出的70株待测菌株,分别对其进行PFGE分型、copB分型、16S rRNA分型、LOS血清型分子分型、高通量测序和生物信息学分析,评估常用分子分型方法的分辨能力和准确性。（2）基于46个毒力基因,选择不同毒力基因组合的19株菌,比较其体外黏附与侵入A549细胞的能力。通过构建小鼠肺部感染模型,分析其肺清除率、肺组织病理改变和细胞因子的产生情况。选取两株致病力和耐药表型存在较大差异的卡他莫拉菌感染A549细胞,提取A549细胞mRNA进行转录组分析。（3）针对TLR2受体,采用TLR2激动剂和抑制剂,同时构建siRNA TLR2 A549细胞以及TLR2-/-A549细胞,再通过黏附试验与侵袭实验、透射电镜等方法,研究TLR2受体在卡他莫拉菌黏附与侵入A549细胞过程中的作用;通过构建TLR2-/-C57/BL6J小鼠肺部感染模型进行体内验证。利用透射电镜、F肌动蛋白/G肌动蛋白比例分析、高内涵成像系统,研究肌动蛋白聚合/解聚调节系统在A549细胞通过巨胞饮方式内化卡他莫拉菌的可能机制。利用免疫印迹方法,针对纤维连接蛋白-α 5 β1型整合素通路与TLR2-PI3K-AKT信号通路,筛选出哪些相关蛋白可能参与了卡他莫拉菌黏附与侵入A549细胞的过程。结果:（1）WGST利用SNPs位点构建了高精细分型系统,PFGE在对同一克隆株或亲缘关系较近的克隆株中,与WGST均显示出高度的一致性和高分辨力,而MLST分辨能力非常有限。copB Ⅱ与CC449高度相关,LOS B型主要集中在CC224中,70株分离株都属于与增加致病潜力和血清抗性有关的16S rRNAI型。卡他莫拉菌毒力基因筛查结果表明,uspA2、uspA2H、pilO、lbpB、lex1、modM、mboIA和mboIB在四种克隆复合群之间以及大环内酯类耐药组和敏感组间存在显著差异。（2）大环内酯类敏感分离株的黏附能力弱但侵入能力强,而大环内酯类耐药株的黏附能力强但侵入能力弱。不同克隆复合群间的黏附和侵入能力也存在显著差别。（3）73-OR对TLR2-/-A549细胞的黏附和侵入能力大大下降,同时TLR2-/-小鼠因TLR2缺失,导致73-OR对肺组织的黏附能力下降,肺清除率明显加快,导致的局部炎症反应也要比正常小鼠感染后的炎症反应轻。卡他莫拉菌通过巨胞饮的形式侵入A549细胞内,肌动蛋白聚合/解聚的调节以及纤维连接蛋白-α 5 β1型整合素系统和TLR2-PI3K-AKT信号通路可能参与了卡他莫拉菌黏附和侵入A549细胞的过程。结论:（1）WGST利用SNPs位点构建了高精细分型系统,大大加深了该研究对大环内酯类耐药卡他莫拉菌起源和进化的理解;大环内酯类耐药克隆株具有明显的“适应性代价”现象,主要表现为生长速度减慢和毒力下降。（2）大环内酯类不同耐药表型的卡他莫拉菌黏附和侵入A549细胞的能力存在巨大差异,敏感分离株的黏附能力弱但侵入能力强,而耐药株的黏附能力强但侵入能力弱。（3）纤维连接蛋白-α5β1型整合素系统和TLR2-PI3K-AKT信号通路可能通过肌动蛋白聚合/解聚的调节参与了卡他莫拉菌黏附和侵入A549细胞的过程。
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