[研究背景和意义]结肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤,严重威胁人类健康。现有的结肠癌治疗方法在结肠癌病人间存在治疗效果的差异,并且结肠癌的转移是结肠癌患者预后不良的一个重要原因。虽然新的化疗药物和靶向治疗方法的发展使转移性结直肠癌病人的临床结果得到了一定改善,但仍有大量病人经历治疗失败和复发转移。因此,探索结肠癌的发生机制及影响预后因素的相关研究,对于结肠癌的特异诊断和精准治疗意义重大。内质网应激是细胞在损伤因素的作用下导致错误折叠与未折叠蛋白在内质网腔内聚集、Ca2+平衡失调的内质网功能紊乱状态。内质网应激的发生会使细胞停止增殖,应激持续存在则会启动细胞凋亡程序。实体肿瘤组织中虽然普遍存在各类细胞应激因素,但肿瘤细胞仍持续增殖,提示肿瘤细胞内质网进化有一套应激条件下保证蛋白合成和正确折叠、装配的保护机制;对结肠癌细胞内质网应激条件下抵抗凋亡的作用及机制研究具有重要意义。内质网氧化还原酶-1α（endoplasmic reticulum oxidoreductin 1α,ERO 1α）是调控内质网腔内蛋白合成、折叠的关键蛋白,研究显示ERO1α过表达在肿瘤生物学中起着关键作用,且其表达水平与肿瘤恶化呈正相关。研究也发现,肝癌细胞在缺氧应激条件下,ERO1α表达水平会迅速升高,敲降ERO1α后可显著促进肝癌细胞凋亡,提示ERO1α极可能是启动内质网应激反应保护机制的上游调控分子之一。有关ERO1α表达与内质网应激对结肠癌进展的关系,目前尚少见研究报道。微小RNA（microRNA,miRNA）作为一种进化保守的非编码RNA分子,在转录后基因调控中发挥重要作用。它可以调控细胞的分化、增殖、凋亡、生长、迁移和存活。越来越多的证据表明,miRNA水平的异常变化与癌症发生发展密切相关。已报道miR-101是多种肿瘤细胞凋亡的促进因子,主要通过抑制其靶蛋白EZH2的表达发挥促凋亡作用。EZH2是多梳蛋白家族的成员,通过催化组蛋白H3赖氨酸27（H3-K27）三甲基化作为组蛋白甲基转移酶,在维持基因沉默中发挥重要作用,参与多种肿瘤的增殖过程。我们前期预实验发现,结肠癌细胞在内质网应激条件下,ERO1α表达上调可抑制miR-101的表达,同时上调EZH2的水平,为此我们提出ERO1α、miR-101和EZH2相互作用调控细胞信号传导通路介导结肠癌的发生发展的研究思路。研究显示Wnt/β-catenin信号通路在结肠癌发生和进展中扮演重要角色,有研究报道EZH2可激活Wnt/β-Catenin通路促进人骨髓间充质干细胞成骨分化,结肠癌细胞中miR-101表达缺失促进Wnt/β-catenin信号通路的激活,为此提出miR-101调控EZH2对Wnt/β-catenin信号通路的激活是ERO1α介导的内质网应激调控结肠癌细胞凋亡的一个潜在机制。本研究对提出的这个科学假设展开验证,揭示内质网应激诱导的细胞凋亡与结肠癌的发生发展的关系,确认ERO1α分子,miR-101/EZH2轴和Wnt/β-catenin信号通路在这一过程中发挥的重要作用,丰富对结肠癌细胞凋亡相关的分子机制的了解,对结肠癌治疗策略提供新的靶点治疗思路。[目 的]探究ERO1α在内质网应激引起的结肠癌细胞凋亡中的作用,揭示内质网应激诱导的细胞凋亡与结肠癌发生、发展的关系,确认ERO1α分子,miR-101/EZH2轴和Wnt/β-catenin信号通路是这一过程发生的潜在机制,为结肠癌细胞凋亡与结肠癌发生、发展相关的分子机制提供理论基础支持,扩充结肠癌诊断和治疗靶点的新思路。[方法]1.收集结直肠癌病人癌组织和癌旁组织,RT-qPCR检测ERO1α、miR-101和EZH2表达水平,免疫组化检测ERO1α表达,χ2检验分析ERO1α蛋白表达与结直肠癌病人临床病理因素的相关性。2.体外培养人正常结肠NCM460细胞,人结肠癌RKO和HT-29细胞,RT-qPCR 检测 ERO1α、miR-101和 EZH2 的表达。3.RKO和HT-29细胞中,THG诱导发生内质网氧化应激,RT-qPCR检测ERO1α、miR-101和EZH2的表达,CCK-8和溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）免疫荧光标记检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡,Western Blot检测凋亡相关蛋白 Bax、caspase-3 和 caspase-9 表达。4.短发卡RNA技术敲降ERO1α（sh-ERO1α）,构建慢病毒载体miR-101和anti-miR-101,构建pcDNA-EZH2过表达载体,THG诱导RKO和HT-29细胞内质网氧化应激发生条件下,转染sh-ERO1α,共转染sh-ERO1α+anti-miR-101,转染miR-101,共转染pcDNA-EZH2+miR-101,同时转染对应阴性对照组,CCK-8和BrdU检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡,Western Blot检测凋亡相关蛋白 Bax、caspase-3 和 caspase-9 表达。5.THG诱导RKO和HT-29细胞氧化应激发生条件下,转染sh-ERO1α,共转染 sh-ERO1α+anti-miR-101,转染 miR-101,共转染 pcDNA-EZH2+miR-101,同时转染对应阴性对照组,Western Blot检测Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白Wnt3a、Wnt5a和β-catenin表达及Wnt/β-catenin通路下游靶基因相关蛋白c-MYC和Cyclin D1的表达。6.裸鼠皮下注射结肠癌细胞悬液、THG诱导氧化应激的结肠癌细胞悬液和THG诱导并敲降sh-ERO1α的结肠癌细胞悬液,构建裸鼠结肠癌皮下种植瘤模型,观察裸鼠成瘤大小,RT-qPCR检测瘤体组织中ERO1α、miRNA-101和EZH2表达,免疫组化检测ERO1α和EZH2表达,Western Blot检测凋亡相关蛋白Bax、caspase-3 和 caspase-9 表达及 Wnt/β-catenin 通路相关蛋白 Wnt3a、Wnt5a 和β-catenin、c-MYC 和 Cyclin D1 的表达。[结 果]1.与癌旁组织相比,ERO1α和EZH2在结直肠癌组织中表达显著上调,miR-101在结直肠癌组织中表达显著下调,差异都具有统计学意义（P＜0.01）,相关性分析显示ERO1α的表达与结直肠癌分化程度、TNM分期和淋巴转移相关。2.与人正常结肠NCM460细胞相比,ERO1α和EZH2在人结肠癌RKO和HT-29细胞中表达显著上调,miR-101的表达则显著下调,差异都具有统计学意义（P＜0.01）。3.THG诱导后,与对照组相比,ERO1α和EZH2在RKO和HT-29细胞中表达显著下调,miR-101的表达显著上调,差异都具有统计学意义（P＜0.01）,同时THG诱导组RKO和HT-29细胞增殖活力显著下降,凋亡率显著升高,差异都具有统计学意义（P＜0.01）。4.与对照组相比,转染sh-ERO1α组RKO和HT-29细胞增殖活力显著下降,凋亡率显著上升,差异都具有统计学意义（P＜0.01）,与转染sh-ERO1α组相比,共转染sh-ERO1α+anti-miR-101组细胞增殖活力上升,凋亡率下降,差异都具有统计学意义（P＜0.05）。与对照组相比,转染miR-101组,RKO和HT-29细胞增殖活力显著下降,凋亡率显著上升,差异都具有统计学意义（P＜0.01）,与转染miR-101组相比,共转染pcDNA-EZH2+miR-101组细胞增殖活力上升,凋亡率下降,差异都具有统计学意义（P＜0.05）。5.与对照组相比,转染sh-ERO1α组,Wnt3a、Wnt5a和β-catenin表达显著下调,同时,Wnt/β-catenin通路下游靶基因相关蛋白c-MYC和Cyclin D1的表达也下调,差异具有统计学意义（P＜0.01）;与转染sh-ERO1α组相比,共转染sh-ERO1α+anti-miR-101 组 Wnt3a、Wnt5a和β-catenin、c-MYC 和 Cyclin D1 表达上调,差异具有统计学意义（P＜0.05）。与对照组相比,转染miR-101组,Wnt3a、Wnt5a和β-catenin、c-MYC和Cyclin D1表达显著下调,差异具有统计学意义（P＜0.01）;与转染 miR-101 组相比,共转染 pcDNA-EZH2+miR-101 组 Wnt3a、Wnt5a和β-catenin、c-MYC和Cyclin D1表达上调,差异具有统计学意义（P＜0.05）。6.与对照组相比,THG组的成瘤体积减小,ERO1α和EZH2表达水平降低,miRNA-101表达水平升高,凋亡相关蛋白Bax、caspase-3和caspase-9表达升高,Wnt/β-catenin通路相关蛋白 Wnt3a、Wnt5a、β-catenin、c-MYC 和 Cyclin D1 的表达也下调;THG+sh-ERO1α组成瘤体积进一步减小,ERO1α和EZH2表达水平进一步降低,miRNA-101表达水平进一步升高,Bax、caspase-3和caspase-9表达进一步升高,Wnt3a、Wnt5a和β-catenin、c-MYC 和 Cyclin D1 表达进一步下调,差异具有统计学意义（P＜0.01,P＜0.001）,同时,THG+sh-ERO1α组与THG组的差异也具有统计学意义（P＜0.01）。[结 论]ERO1α和EZH2在结直肠癌组织和结肠癌细胞系中表达上调,miRNA-101则表达下调,而THG内质网氧化应激的诱导可以逆转这一现象。ERO1α参与了内质网应激诱导的RKO和HT-29细胞的凋亡和增殖,主要是通过调节miR-101/EZH2轴和影响Wnt/β-catenin信号通路发挥作用。