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卵母细胞减数分裂是随后胚胎细胞有丝分裂及其分化发育的重要基础。减数分裂过程涉及多个环节,并受到一系列细胞周期调控因子在时间和空间上精确有序的调节。Plk1(Polo-like kinase 1)作为调节细胞有丝分裂的一种高度保守的丝/苏氨酸蛋白激酶,是否参与猪卵母细胞减数分裂的调控目前尚不明确。本研究首先采用western blot检测了 Plk1及其p-Plk1(Thr-210)在猪卵母细胞成熟分裂过程中的表达特点,并通过间接免疫荧光结合激光共聚焦成像分析其在卵母细胞减数分裂各时期的亚细胞定位规律;随后用Plk1特异性抑制剂GSK461364处理GV期(germinal vesical stage)卵母细胞,分析Plk1抑制对卵母细胞成熟及其亚细胞骨架的影响。最后,采用MLN8054对Aurora A激酶进行特异性抑制处理,通过分析p-Aurora A(Thr-288)和p-Plk1(Thr-210)活性的变化及其对纺锤体组装的影响,进一步探究Aurora A是否是Plk1调控卵母细胞减数分裂的上游调节因子。具体试验结果如下:试验一、Plk1在猪卵母细胞成熟过程中的动态表达及亚细胞定位通过western blot试验发现Plk1及其p-Plk1(Thr-210)在猪卵母细胞成熟分裂过程中均持续表达,且Plk1的表达量在此过程中持续升高至ATI期(anahphase and telophase Ⅰ stage),随后下降,GV 期与 GVBD 期(germinal vesical break down stage)相比,Plk1表达量没有明显差异;p-Plk1(Thr-210)在此过程中持续稳定表达,且其表达量均低于Plk1。通过间接免疫荧光和激光共聚焦发现,在GV期,染色体凝集成戒指状,Plkl均匀分布在生发泡外;进入GVBD期时,生发泡破裂,Plk1开始凝集成蜂窝状,富集在凝集的染色体周围;随后细胞发育至MI期(metaphase Ⅰ stage),凝集的染色体成线状排列在赤道板上,Plk1则转移至赤道板的两侧且对称分布;到ATI期时,染色体在纺锤体的牵引下往两极移动,Plk1富集至两组染色体之间;至MII期(metaphase Ⅱ stage),第一极体排出,染色体重新排列成线状,Plk1在染色体两极聚集,在极体处也有少量Plk1富集。据此,我们推测在猪卵母细胞成熟过程中,Plk1的定位与α-tubulin的分布极有可能具有相似的定位与分布。为进一步证实这一预测,我们随后将Plk1与α-tubulin进行共染,并将二者荧光合并,结果发现在猪卵母细胞成熟过程中,Plk1与α-tubulin的荧光高度重合。这一结果提示Plk1的亚细胞定位与α-tubulin的动态分布关系密切。试验二、GSK461364对猪卵母细胞成熟及MI期染色体和纺锤体的影响为深入探究Plk1在猪卵母细胞减数分裂过程中的作用,本研究采用不同浓度的Plk1特异性抑制剂GSK461364处理GV期卵母细胞,体外培养至44 h,结果发现第一极体排出率呈浓度依赖性降低,发育至MⅡ期的卵母细胞数目逐渐减少,而停滞在GVBD期的卵母细胞比例显著增多。进一步通过激光共聚焦显微成像发现处理组的细胞染色体虽然已凝集成点状,但未整齐地排列在赤道板上,且α-tubulin富集在染色体周围,也未组装成典型的纺锤体结构。收集Plk1抑制后能发育至成熟的卵母细胞,激活后进一步培养,结果发现处理组的卵裂率和囊胚率均有明显下降。这些结果表明Plk1主要通过影响纺锤体组装和染色体排列参与卵母细胞减数分裂过程的调控,并对细胞的随后胚胎发育潜力也具有重要的影响。试验三、Plk1调控猪卵母细胞减数分裂的作用机制为深入探究Plk1对卵母细胞减数分裂的调控机制,分析Aurora A是否为Plk 1调节卵母细胞减数分裂的上游调节因子,本研究用AuroraA特异性抑制剂(MLN8054)处理卵母细胞后,发现处理组细胞形态大多表现为染色体凝集成点状,但未排列在赤道板上,α-tubulin分布在染色体周围,也未形成典型的纺锤体结构,这些结果与Plk1抑制后的表型极其相似。进一步通过western blot检测发现当Aurora A抑制后,处理组卵母细胞的p-Plk1(Thr-210)水平伴随着p-AuroraA(Thr-288)的下降而下降,且在MI期和对照组相比均差异显著。这些结果提示Plk1对猪卵母细胞减数分裂的调节作用受其上游Aurora A活性的调控。