来源于植物的木质纤维素产量巨大、来源广泛,是自然界最为丰富的可再生资源。但木质纤维素由于其自身复杂的结构而导致其较低的降解转化效率严重阻碍了其大规模产业化应用。近几十年来,国内外研究报道了众多纤维素降解微生物及其纤维素水解酶系,并对纤维素的生物降解过程提出了多种机制阐述,为实现以木质纤维素为原料的可再生资源与能源的开发奠定了理论基础。好氧的革兰氏阴性菌Cytophaga hutchinsonii具有高效降解纤维素的能力。然而不同于其他已知好氧菌和厌氧菌的分泌型纤维素酶系降解体系和复合体型的纤维小体模式,C.hutchinsonii被认为具有独特的纤维素降解机制,是探究纤维素降解理论及实际转化应用的良好材料。目前对C.hutchinsonii降解纤维素机制的研究主要集中在其纤维素水解酶组份、重要的外膜蛋白及滑动运动等相关基因的研究方面,而对于其响应纤维素底物触发其纤维素水解过程的调控机制还未见报道。胞质外功能 σ 因子（Extracytoplasmic function σ factor,ECF σ）是一类简单多变的可替代σ因子。研究发现细菌对外界应力的感知和应答很多情况下是通过ECF σ因子的调控来完成的。由于C.hutchinsonii可高效降解纤维素,且降解过程绝对依赖于底物接触,我们推测C.hutchinsonii对纤维素碳源的响应也会涉及到一系列调控因子,并通过改变全局性转录模式来实现其碳源利用模式的迅速转换。目前还未见在C.hutchinsonii中报道与纤维素利用相关ECF σ因子的鉴定,这极大限制了对C.hutchinsonii降解纤维素机制的深入探究。因此,与纤维素利用相关的ECF σ因子的鉴定和功能解析是全面阐述C.hutchinsonii纤维素降解机理的一个重要环节。本论文在C.hutchinsonii中通过转座诱变的方法筛选鉴定到一个与纤维素利用相关的ECF σ因子,一方面通过体内外实验分析它和anti-σ因子之间可能的相互作用模式及其影响因素,以及此种模式的改变对纤维素降解利用能力的影响;另一方面通过转录组分析寻找鉴定受ECF σ因子调控的下游靶基因。此外,我们还找到了另一对参与C.hutchinsonii降解利用纤维素过程调控的ECF σ与anti-σ因子组合对,并发现了一个对纤维素利用非常重要的潜在的Ⅱ型蛋白分泌系统。因此,论文工作主要从上述几个方面展开,取得相应结果如下:一、筛选鉴定到一个与纤维素降解利用相关的ECF σ因子SigE,遗传表型分析证明SigE和HtrA家族蛋白酶同源物HtrACh为C.hutchinsonii降解利用纤维素所必需。利用转座子诱变筛选,我们得到一株纤维素利用缺陷菌株并将其命名为MT2405（M3097）,通过质粒拯救及序列测定确定转座子插入位点为CHU3097。该基因注释为ECF σ因子SigE,随后对该基因失活菌株的重组回补表型进行分析,证实了突变株的纤维素利用缺失表型是由CHU3097基因的失活所导致。进一步的生物信息学分析表明,其下游基因预测为可能的anti-σ因子anti-SigE,对其进行敲除后发现anti-SigE的缺失对纤维素的利用并没有影响。此外,我们找到一个可能与SigE功能相关的HtrA家族蛋白HtrACh。对其编码基因进行插入失活和回补分析,结果发现HtrACh与SigE同样为C.hutchinsonii利用纤维素所必需。SigE可以恢复HtrACh缺失菌的纤维素利用缺陷表型,但其却不能回补anti-SigE和HtrACh同时缺失导致的纤维素利用缺陷表型。综合以上的遗传学分析,我们推测SigE可能是HtrACh的一个下游调控元件,但与HtrACh单独缺失不同,anti-SigE和HtrACh的同时缺失可能导致SigE在体内的功能状态发生变化,从而导致双缺菌株的纤维素利用缺陷不能够被SigE所回补。二、体外实验表明SigE与anti-SigE存在相互作用,但两者在细胞膜上的存在状态不同。anti-SigE以聚体的形式紧密结合于细胞膜上,而SigE大部分存在于细胞膜上,但在纤维素诱导条件下可部分被释放到胞质中,且其活性状态受anti-SigE 和 HrtACh 的影响。我们通过在大肠杆菌中异源共表达带有不同标签的SigE和anti-SigE,验证了二者间存在直接相互作用。通过细胞分级分离和Western blot分析二者的细胞定位发现,SigE和anti-SigE均存在于细胞膜上,但anti-SigE以聚体的形式存在,且其在细胞膜的吸附紧密程度高于SigE。SigE在纤维素诱导条件下可以部分被释放到细胞质中,而在anti-SigE缺失菌株中,SigE在葡萄糖条件下就可以在细胞质中被检测到,表明anti-SigE与SigE相互作用可能是调控SigE活性功能的一个重要环节。进一步分析显示,在HtrACh缺失菌株中,SigE无论在诱导和非诱导条件下都只存在于细胞膜上;然而在anti-SigE和HtrACh双缺菌株中,SigE在细胞膜上的状态发生了变化,除了正常的信号条带外,我们还检测到了一条分子量较小的条带。结合之前的遗传表型分析结果,上述结果表明SigE响应纤维素的胞质释放并非其发挥功能所必须,且HtrACh可能并非通过水解anti-SigE来实现对SigE活性的控制转换,而更可能是通过影响anti-SigE和SigE间的相互作用模式来影响对纤维素的响应。HtrACh和anti-SigE的同时缺失会导致SigE的稳定性及活性状态发生改变从而影响其对纤维响应过程的控制。三、通过转录组分析找到了受SigE调控的下游靶基因,其中CHU 1276为其中一个重要的下游调控基因。分别提取在葡萄糖,结晶纤维素和无碳源三种不同的培养条下野生型和突变株M3097的总RNA,分离mRNA并进行全序列测序,首先对得到的转录组数据从数量上进行分析归类,发现与葡萄糖或者无碳源条件下相比,在结晶纤维素条件下突变株M3097和野生型相比上调基因和下调基因数量更多,说明SigE是响应纤维素碳源的可能性较大。为了找到SigE调控的下游靶基因,我们进一步分析M3097与野生型相比在Avicel诱导条件下特异性差异表达基因,从特异性下调基因中我们找到了可能受SigE调控的下游靶基因,并对一些有注释功能及未知功能的靶基因进行插入失活及敲除验证,对不同突变株的生长表型进行了初步分析。通过CHU1276对SigE缺失菌株的回补及回补分析发现CHU 1276是一个非常重要的受SigE调控的下游基因。四、通过转录组分析鉴定了另一对ECFσ/anti-σ因子。遗传表型分析表明,两者对C.hutchinsonii纤维素的利用均非常重要,且初步结果表明其作用模式不同于第一对ECF σ与anti-σ因子。通过对SigE缺失菌和野生型菌株的转录组比较分析,我们找到了一个可能受SigE调控并且特异性响应纤维素碳源的ECF σ因子SigF。生物信息学分析发现其下游基因可能是与之相关的anti-SigF。我们通过基因敲除或插入失活的方法验证了 SigF和anti-SigF对于纤维素的利用均非常重要。利用细菌双杂交方法验证了二者体外存在相互作用。进一步对SigF与anti-SigF可能存在相互作用区段的氨基酸进行突变（T4A,L9P,R15G,A23G,W35G,W41V,S59G）分析,然而并没有找到关键的作用位点,两者间具体的作用模式及其在相关信号传递响应过程中的功能分析还需要进一步的研究探讨。五、发现一个Ⅱ型分泌系统（T2SS）基因簇,该基因簇在Chutchinsonii纤维素降解过程中发挥重要功能。前期的研究结果暗示C.hutchinsonii中某些特殊的分泌体系可能通过改变外膜表面或者细胞外蛋白组成来参与菌体与纤维素的吸附,进而影响对纤维素的降解。通过上述转录组分析,我们找到了一个可能受SigE调控并且特异性响应纤维素碳源的Ⅱ型分泌系统组分T2S-F。通过生物信息学分析,我们发现与其相邻的基因编码另外两个Ⅱ型分泌系统组分同源物T2S-D及T2S-G。随后我们对这三个基因进行单独敲除和插入失活。实验结果表明这三个T2S基因失活后均会导致菌体在纤维二糖、可再生无定型纤维素及结晶纤维素上的生长明显延迟的结果。与野生型相比,T2S基因突变株菌体的内切葡聚糖酶酶活升高,但是β-葡萄糖苷酶酶活显著降低。研究还发现,虽然T2S基因失活突变株菌体的运动能力并没有受到影响,但其纤维素吸附外膜蛋白发生部分缺失且纤维素吸附能力显著下降。综上所述,我们推测鉴定到的C.hutchinsonii Ⅱ型分泌系统T2S基因在纤维素的利用中发挥重要的作用,为全面阐述C.hutchinsonii新颖的纤维素利用机制提供了线索。