生菜(Lactuca sativa)是世界上最重要的蔬菜之一。红色生菜由于其色泽及其健康保健功能,逐渐受到更多消费者的青睐。生菜叶片的红色主要是由花青素类物质在叶表皮细胞积累形成。叶片颜色是生菜的重要农艺性状之一,产生颜色的花青素有抗氧化能力,具有抗癌抗衰老的作用。然而到目前为止关于生菜叶片颜色的相关研究仍然较少。本实验利用红色生菜和绿色油麦菜进行杂交,构建F2叶色分离群体,通过传统遗传学和第二代测序技术相结合的方法,精细定位并克隆了3个控制生菜红色叶片性状的基因(Red Lettuce Leaves 1-3,RLL1-3),并系统分析它们的作用机理,为进一步了解花青素的合成与调控以及培育高花青素含量的生菜品种奠定基础。主要结果如下:1.红色生菜亲本S1与绿色油麦菜亲本Y37杂交后自交得到F2分离群体,表型分析以及混合池(BSA)+RNA-Seq分析均表明该群体的叶色由多个质量性状和数量性状控制。在候选区域开发分子标记扫描F2群体,最后锁定5号染色体存在两个主效基因位点,命名为RLL1和RLL2。2.为了将多基因性状进行单基因化,在RLL1和RLL2候选区域开发分子标记,从F2群体中挑选RLL1区域为杂合,RLL2区域为显性纯合的植株自交得到RLL1的单基因分离F2:3群体;用同样方法获得RLL2的单基因分离群体。3.用BSA+RNA-Seq方法对RLL1单基因分离群体进行验证,然后扩大经验证的群体,并从6,851株植株中挑出1,751株隐性植株作为精细定位群体。利用该群体将RLL1位点定位在生菜第5号染色体404.3-407.2 Mb之间,并最终成功克隆了RLL1基因。RLL1编码一个b HLH转录因子,该基因在绿色亲本中有一个5 bp的缺失突变,导致其功能缺失。转基因验证了该基因的功能。该基因调控多个花青素合成途径结构基因的表达,酵母单杂交显示其编码蛋白与DFR和ANS的启动子顺式元件结合。4.种植RLL2单基因分离群体共5,430株,并以其中的1,372株隐性植株作为精细定位群体,用上述方法将RLL2基因定位在5号染色体的一个未组装区域(gap)。通过分析该群体两个混合池之间所有SNP频率差异,发现生菜未组装的一个scaffold与RLL2共分离,该scaffold上一个编码R2R3-MYB转录因子的基因选定为RLL2候选基因。该基因在紫色亲本中存在,并高量表达,但在绿色亲本中缺失,呈现有无多态性。将该基因转入单基因分离群体中的绿色植株导致叶色转为红色。RLL2蛋白结合花青素合成途径结构基因DFR和ANS的启动子顺式元件。5.在精细定位RLL2的过程中发现RLL3位点。RLL3是花青素合成的负调控因子,通过F3:4亚群体进行精细定位,最终成功克隆了RLL3。RLL3编码一个R3-MYB转录因子,酵母双杂交等实验表明RLL3是通过与R2R3-MYB竞争结合b HLH转录因子来抑制花青素的合成。6.RLL1-3基因进化分析。从栽培和野生生菜中PCR扩增RLL1和RLL3基因序列并进行进化分析,发现两个基因的功能变化都发生在驯化后。RLL1的突变使植株失去合成花青素的能力,植株变成绿色;RLL3的突变使植株表现的红色更深。在驯化过程中,生菜叶片色泽向两个极端方向进行,呈现典型的歧化选择(disruptive selection)模式。本研究克隆的3个控制生菜叶色的基因可直接应用于生菜的育种。同时对3个基因的分子作用机理的解析丰富了植物花青素代谢调控的研究。本研究为进化学提供一个典型的歧化选择例子。