铜绿假单胞菌是一种重要的条件致病菌，它能在机体腔道、各种组织及体内留置的生物医学材料的表面形成生物被膜，从而导致顽固性感染。据文献报导，鞭毛介导的泳动和Ⅳ型菌毛介导的蹭动在被膜形成的早期起重要作用，这两种运动能力丧失的突变子，不能在塑料表面形成生物被膜。本文以一株临床分离的铜绿假单胞菌PA68做受体菌，应用Mu转座复合物技术从反向遗传学的角度对鞭毛和Ⅳ型菌毛运动的相关基因进行研究。 Mu转座复合物技术近两年刚兴起，尚未见应用到假单胞菌属的报导，本文先以质粒pSMC28代替Mu转座复合物对PA68的电转化条件进行优化。详细研究了细菌生长状态、感受态细胞的浓度和贮备方式，以及电脉冲场强等参数对转化效率的影响，结果表明：在细胞生长至对数期(OD₅₄₀=0.7-0.8)时收集菌体，在低温条件下，制备成浓度为10¹¹cells／ml的感受态细胞，设置高脉冲场强（13kV／cm）电击，能获得1.68×10⁸CFU／μg DNA的最高转化效率。选用生长时期和电击电压两个主要参数验证Mu转座复合物对PA68的电转化条件，结果表明Mu转座复合物与质粒的最佳电转化条件相一致。用筛选出的优化条件成功地将Mu转座复合物转入到PA68中，得到3.66×10⁴CFU／μg DNA的高转化效率，建立了菌株PA68的Mu转座突变文库。 对Mu转座突变子进行泳动和蹭动能力的检测，从约2000个突变子中，筛选出泳动能力缺陷型突变子4株，蹭动能力丧失或减弱的突变子11株。Sournthern杂交证实转座子均为单拷贝插入。将转座子及其侧翼的基因组序列克隆到pUC18载体上，以转座子末端的反向序列做引物，对其侧翼的基因组序列进行核苷酸测序，并将测序结果在GenBank中进行BLAST比对，从而确定转座子插入到基因组中的位置。结果显示，4个泳动缺陷型突变子中，转座子分别插入到uvrD、phzF1、zwf和PA0171 4个基因中；11个蹭动缺陷型突变子中，转座子分别插入到8个不同基因的内部：有三个分别插入到PA0413基因的前端，中部和后端；有两个分别插入到pilQ的不同位置；其它突变子中，转座子分别插入到pilV、algR、PA1821、PA1822、PA4959和PA0171中。上述11个基因中，有6个基因属于Ⅰ类或Ⅱ类基因，它们的功能已在铜绿假单胞菌或其它菌株南开大学博士研究生毕业（学位）论文中得到实验证实;PAO4!3和PAj82]属于m类基因，其功能是根据它们所编码蛋白质的保守氨基酸基序或其基因序列与己知功能基因的相似性推测得出的，但缺乏实验证据;PA4好夕，PAI822和PA口171则属于W类基因，但最新的一篇研究报道证明PA刃卯为一信号蛋白，参与铜绿假单胞菌的蹭动，PA0171和PA了822的功能则完全未知。 对基因PA口了71和PA了822进行了核普酸序列测定。序列比对发现PA了822的编码产物与一种信号传导蛋白PilL有一定的同源性，PA口了71则与任何功能已知或未知的基因都没有高同源性。利用反向互补实验进一步研究基因PA017]和PA1822的功能，结果表明，携带PA0171基因的质粒pDN18S使突变子PA68PA 0171::Mu的蹭动和泳动能力均恢复至正常水平;而携带PA j822基因的质粒pDN 18F则使突变子PA68PA了822::Mu的蹭动能力得以部分恢复。根据同源重组原理，用插入失活的基因置换出染色体上的正常基因，在铜绿假单胞菌标准株PAOI中分别构建了基因PA017)和PAI822失活的突变子。运动能力检测显示，突变子PAO IPA口了71::Gmr丧失了泳动和蹭动能力;而突变子PAO IPA1822::Gmr则没有蹭动能力。上述实验结果证明PA017]基因参与了p aeruginosa的泳动和蹭动，PAI822基因则为蹭动所必需。 在电子显微镜下观察PA017I突变子和PAI822突变子的细菌形态，结果表明，PA0j7)突变子有正常的鞭毛，但IV型菌毛缺失;别1822突变子的鞭毛和IV型菌毛均完好存在，推测PAOI7)可能为一调节基因，控制鞭毛和IV型菌毛的运动，同时控制IV型菌毛的生物合成。而PA了822可能是一个信号蛋白，能够感受外界环境信号的刺激从而调节IV型菌毛的运动。 本文首次将Mu转座复合物技术应用到假单胞菌的功能基因组的研究中，为假单胞菌属的研究提供了一个新的遗传学手段。并首次证明PA1822和PAOI7!基因与P. areuginosa的运动有关，为透彻理解生物被膜的形成机制提供了实验依据。