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研究背景和目的:据报道,脂联素(APN)在调节骨矿物质密度(BMD)中起着重要作用,并作为骨代谢的调节因子而不可或缺。然而,目前学术界研究中关于它在破骨细胞的诱导和分化过程中的调控机制及其影响仍不十分清楚。有研究证实核因子Kappa B(NF-kB)蛋白活化是成熟破骨细胞存活和发挥功能的重要调节因子。此外,有研究发现骨质疏松的发生、发展与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路存在密切关系。我们课题组通过研究已发现脂联素在腰椎小关节骨性关节炎(FJOA)中软骨及软骨下骨有表达,但具体作用机制仍不很明确。据此,在我们的研究中,进一步通过体外实验探讨APN干预培养的RAW264.7细胞后,观察破骨细胞生成和骨细胞介导性骨溶解的影响以及NF-kB信号通路、MAPK信号通路的变化,并深入研究其可能的作用机制。方法:1.细胞活力及IC50检测:(1)RAW264.7细胞系培养:RAW264.7用含10%胎牛血清的α-MEM培养基培养,细胞在经过3次传代后用于后续实验。(2)以不同浓度APN分别作用RAW264.7细胞,孵育培养12h、24h、48h及72h后,于酶标仪450nm波长下测定细胞的吸光度值。2.破骨细胞诱导实验:(1)不同浓度APN诱导:用含不同浓度的脂联素(在IC50范围内)及RANKL(核因子-kB受体活化因子配基)共同刺激RAW264.7,连续培养5天,直到镜下观察破骨细胞形成并行TRAP(抗酒石酸酸性磷酸酶)染色,镜下拍照。(2)培养周期的诱导实验:用一定浓度的脂联素及RANKL共同刺激RAW264.7,分别于第1天、第3天及第5天行TRAP染色,并镜下拍照保存计数成熟破骨细胞及相应面积的换算。3.相关通路蛋白的检测:(1)短时间作用的蛋白:实验分为两组:RANKL组和RANKL+APN组,分别作用RAW264.7细胞0,5,10,20,30,60 min后,提取细胞总蛋白,检测相关蛋白:IkBα,p-IkBα,p-p65,p65,p-p38,p38,p-JNK,JNK,p-ERK,ERK,β-actin的表达。(2)长时间作用的蛋白:实验分为两组:RANKL组和RANKL+APN组,分别处理RAW264.7细胞0,1,3天后,提取细胞总蛋白,检测相关蛋白:NFATc1,c-fos,β-actin的表达。4.破骨相关基因测定:实验分为两组:RANKL组和RANKL+APN组,分别作用RAW264.7细胞0,1,3,5天后,提取细胞总RNA,检测基因:DC-STAMP,TRAP,CK,CTR,V-ATPase a3,V-ATPase d2,NFATc1,c-fos,GAPDH的mRNA丰度表达。结果:1.APN对RAW264.7细胞的增殖影响及IC50(1)数据分析得出,当APN的浓度为10、20、30μg/ml时,RAW264.7的增殖受到明显抑制,两两比较存在较大差异,且具有统计学意义(P<0.01)。(2)经数据转换后得出APN对RAW264.7细胞的IC50,于24h、48h分别对应的APN浓度为:10.21μg/ml和9.50μg/ml。2.APN对破骨细胞诱导的作用(1)当APN浓度为0μg/ml时,发现该组经TRAP染色后的镜下成熟的破骨细胞数量及面积均较1、5μg/ml组明显增多,具有显著的统计学差异(P<0.01)。(2)含APN组在RAW264.7细胞诱导第3、5天时,TRAP染色可见与对照组比较,成熟的破骨细胞的数量和面积均明显减少,具有明显的统计学意义(P<0.01)。3.NF-kB信号通路和MAPK信号通路相关蛋白的表达(1)短时间变化的蛋白的表达:经Western blot检测,无论有无APN干预,p-JNK,JNK,p-ERK,ERK在不同的时间段内均无明显变化(P>0.05);在含APN处理组中IkBα的表达于20、30 min时较对照组增多(P<0.01);而p-IkBα的表达于10、20、30 min时较对照组降低(P<0.01);与对照组相比较时,APN处理组中p-p65/p65比值于5、10、20、30、60 min时明显降低(P<0.01);同样,p-p38/p38比值在5、10、20、30 min时APN组较对照组明显降低(P<0.01)。(2)长时间变化的蛋白的表达:经Western blot检测,NFATc1和c-fos的表达在脂联素处理细胞的第1、3天时,其含量较对照组均有所显著降低(P<0.01)。4.APN对破骨相关基因表达的作用经PCR技术检测得出,含脂联素处理的细胞在培养第1、3天时,相关的破骨特异性基因:DC-STAMP,TRAP,CK,CTR,V-ATPase a3,V-ATPase d2,NFATc1,c-fos的mRNA的丰度表达均较对照组明显降低(P<0.01)。结论:1.APN对RAW264.7细胞的增殖起抑制作用,且这种作用呈浓度-时间依赖关系存在。2.APN对成熟破骨细胞的形成具有明显的抑制作用,且这种作用与脂联素的浓度呈依赖关系。3.APN通过抑制IkBα/NF-kB信号通路和p38/MAPK信号通路从而影响破骨细胞诱导的形成。