【摘 要】
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外泌体是细胞分泌的一种胞外囊泡,具有脂质双分子层结构,其内包含有蛋白质、核酸等物质。研究发现,外泌体作为“信使”参与细胞内的各种生理和病理过程,尤其是在肿瘤的生长发展过程中起着重要的作用。近几年液态活检兴起,外泌体作为一种新型标志物在肿瘤诊断、监测和治疗方面表现出巨大的临床应用潜能。通过比较不同样品来源的外泌体蛋白质表达图谱,寻找特异的蛋白质成分或者表达量的差别,发掘潜在的肿瘤蛋白质标志物或者特定
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外泌体是细胞分泌的一种胞外囊泡,具有脂质双分子层结构,其内包含有蛋白质、核酸等物质。研究发现,外泌体作为“信使”参与细胞内的各种生理和病理过程,尤其是在肿瘤的生长发展过程中起着重要的作用。近几年液态活检兴起,外泌体作为一种新型标志物在肿瘤诊断、监测和治疗方面表现出巨大的临床应用潜能。通过比较不同样品来源的外泌体蛋白质表达图谱,寻找特异的蛋白质成分或者表达量的差别,发掘潜在的肿瘤蛋白质标志物或者特定的蛋白质组合,可为肿瘤临床诊断和预后分析提供新的靶标。本论文基于CRISPR-Cas系统构建了两种新型光学传感器分别用于肿瘤来源外泌体的表面蛋白图谱构建及表面蛋白PD-L1的定量检测,本论文的研究内容主要包括以下两部分:（1）外泌体作为恶性肿瘤诊断的非侵入性生物标志物具有巨大的研究前景,其表面蛋白具有巨大的异质性,基于外泌体的特异性和其膜蛋白的多重分析对疾病诊断和生物学功能的探索具有重要意义。本文构建了一种双靶标识别激活CRISPR-Cas12a系统的新型荧光传感器用于肿瘤外泌体表面蛋白图谱构建。该光学传感器的识别部分是由两种蛋白的适配体序列及封闭探针构成,当外泌体出现时,适配体序列结合至外泌体表面相应蛋白,将封闭探针释放,释放的封闭链引发链置换反应,置换出CRISPR-Cas12a系统的靶标链,激活CRISPR-Cas12a系统;该系统的反式切割活性切割体系中两端标记荧光及淬灭基团的单链DNA,产生荧光信号。该策略使用双靶标识别的方式,提高了检测的精确性,具有高灵敏度和高特异性,实现了10~3-10~6 particles/m L的检测范围,且可以通过简单地改变特异性适配子来区分和鉴别不同的外泌体表面蛋白,成功识别4种不同肿瘤细胞来源外泌体,验证了外泌体的异质性。该技术提供了一种高灵敏度、高特异性的外泌体蛋白分析的新方法,在恶性肿瘤诊断中具有广阔应用前景。（2）近几年在免疫治疗中受到广泛关注的程序性死亡配体1（PD-L1）逐渐成为一种非常有潜力的癌症诊断指标,但此蛋白并不具有肿瘤特异性,目前相关检测方法具有较高假阳性,需要研究一种针对肿瘤来源外泌体上PD-L1特异性检测的技术。本研究建立了一种基于Ep CAM和PD-L1双靶标识别的新型光学传感器用于追踪肿瘤来源外泌体表面蛋白PD-L1。只有在肿瘤特异性蛋白Ep CAM和PD-L1蛋白同时存在的时候,才能够引发滚环扩增反应,扩增出CRISPR-Cas12a系统的目标链,激活该系统,最后通过CRISPR-Cas12a的反式切割活性产生荧光信号,通过荧光信号的强弱实现肿瘤来源外泌体PD-L1定量检测。该策略具有较高的灵敏度,检测限低至7.59×10~2 particles/m L,且比单一靶标识别策略具有更高的特异性与良好的通用性,为肿瘤来源外泌体上PD-L1蛋白的检测提供了一种新策略。
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