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细胞从外界获取或自身产生的脂质可以储存在脂滴中,而研究表明,脂滴是细胞脂质代谢发生的重要场所。脂滴是由中性脂质核心和表面单层磷脂膜构成的近似球形的细胞器,其表面结合有众多相关蛋白。脂滴可以与多种细胞器互作,参与多种细胞过程。此外,脂滴在细胞质中运动迅速,是一种高度动态的细胞器。研究脂滴功能对解析脂肪代谢机理有重要的意义和价值。然而,脂滴在细胞中的功能以及其参与各种细胞过程的分子机制尚未完全明确。本研究发现脂滴含量较高的细胞可以抵抗过氧化氢诱导的细胞氧化应激和凋亡。通过脂滴蛋白质质谱检测发现脂滴参与细胞骨架及线粒体相关生物过程,进一步通过亚细胞器标记、分离,激光共聚焦显微镜观测,免疫沉淀质谱联合分析,免疫共沉淀联合免疫印迹检测,信号通路分析,实时荧光定量检测,蛋白免疫印迹分析,活细胞工作站观测等方法揭示了脂滴通过其表面蛋白Actinin(ACTN)和Perilipin5(PLIN5)分别对细胞微丝骨架重塑和线粒体活性进行调控,从而调节细胞氧化应激水平。它促进微丝骨架重塑而维持细胞形态稳定,通过增强线粒体活性来减少线粒体损伤从而降低ROS水平。脂滴还通过这两种方式降低细胞氧化应激损伤,促进细胞生存。本研究从细胞器互作的角度解析脂滴调控细胞氧化应激的分子机理,并发现了脂滴对细胞骨架相关生物过程的调控作用并解析了分子机制,对脂滴的生物功能研究提供了新的思路,为后续猪脂肪代谢相关研究提供了线索。主要研究结果如下:1.脂滴调控细胞微丝骨架的重塑并维持其稳定,进而抵抗氧化应激脂滴维持氧化应激下猪骨骼肌卫星细胞微丝结构的稳定。使用油酸孵育猪骨骼肌卫星细胞(PMSC)以增加脂滴含量,使用过氧化氢刺激、相差显微镜观察发现,脂滴含量高的细胞形态保持好且死细胞数量更少。标记细胞微丝后发现脂滴含量高的细胞微丝结构较完整。(1)脂滴调控细胞微丝骨架重塑。在小鼠成肌细胞C2C12中,利用细胞松弛素B破坏微丝骨架结构后,在微丝骨架重塑过程中脂滴数量增多,并且脂滴含量更高的细胞微丝骨架重塑的速度更快。机制上发现微丝骨架重塑时脂滴表面ACTN3转移至微丝。在微丝骨架重塑过程中的作用,发现ACTN3延微丝分布且与脂滴存在共定位,且脂滴表面的ACTN3在微丝骨架重塑过程中水平下降。接着我们构建脂滴靶向ACTN3荧光标记载体,使用激光共聚焦显微镜观测发现脂滴表面ACTN3在微丝骨架重塑过程中转移至微丝上,且分离亚细胞器后免疫印迹检测也支持荧光观测结果。(2)ACTN3通过结合脂滴蛋白ACSL3和LPCAT1招募在脂滴表面。我们利用免疫沉淀联合质谱技术筛选到脂滴蛋白Acyl-Co A Synthetase Long Chain Family Member 3(ACSL3)和Lysophosphatidylcholine Acyltransferase 1(LPCAT1)与ACTN3结合,并进一步利用免疫共沉淀技术检测到Actinin的Spectrin重复序列(SR域)与这两个脂滴蛋白结合,同时干涉ACSL3和LPCAT1显著降低了脂滴表面的ACTN3水平。(3)ARF1膜泡转运系统介导了脂滴表面ACTN3蛋白到微丝的转运。我们进一步通过脂滴与ARF1-COPI膜泡的共定位分析发现破坏微丝骨架结构后脂滴与膜泡接触增加,干涉ARF1并同时使用Brefeldin A处理显著抑制了ARF1-COPI膜泡的数量,导致微丝骨架重塑过程中脂滴表面ACTN3向微丝转移被抑制。(4)脂滴通过增强细胞迁移融合促进成肌细胞分化。C2C12细胞分化过程中发生了微丝骨架重塑,脂滴表面的ACTN3在分化中转移至微丝上,并且过表达脂滴靶向的ACTN3也可以促进肌细胞分化。(5)微丝骨架的稳定影响细胞内氧化应激水平。使用细胞松弛素处理细胞后ROS水平升高,氧化应激增强;而使用细胞骨架稳定剂JASP可以抵抗过氧化氢诱导的氧化应激。2.脂滴蛋白PLIN5通过增强线粒体活性抵抗氧化应激(1)脂滴降低氧化应激下PMSC的线粒体损伤。前述PMSC试验中,流式细胞检测表明脂滴含量高的细胞中线粒体膜电位更高、ROS水平和凋亡比率更低。(2)PLIN5表达调节细胞ROS水平。PLIN5在脂多糖或过氧化氢处理后表达上调,在细胞中过表达PLIN5后细胞内ROS水平下降;此外,过表达PLIN5可以抵抗过氧化氢诱导的ROS水平升高。干涉PLIN5的结果相反。(3)PLIN5调节线粒体活性。过表达PLIN5可以抑制线粒体细胞色素c的释放并抵抗过氧化氢诱导的线粒体膜电位下降。干涉PLIN5的结果相反。(4)PLIN5调节线粒体功能基因的表达。通过检测线粒体活性相关基因表达水平,发现过表达PLIN5可以上调线粒体呼吸酶类基因COX、CS等的表达,并且调节部分细胞抗氧化基因的表达。干涉PLIN5的结果相反。(5)氧化应激下PLIN5的表达受到JNK-p38-ATF信号通路调控。进一步分析调控PLIN5表达水平的上游信号通路,发现过氧化氢处理可以激活JNK-p38信号,下游ATF表达被随之激活,而ATF1、ATF3和ATF4可以结合PLIN5启动子区域激活PLIN5转录。通路抑制剂GS-4997可以抑制过氧化氢诱导的PLIN5表达上调。(6)氧化应激下PLIN5对脂滴及线粒体的调控作用。通过荧光标记发现PLIN5可以促进脂滴生成,并且过氧化氢处理介导的PLIN5表达升高可以促进脂滴与线粒体接触。(7)PLIN5对氧化应激相关疾病的影响。PLIN5在小鼠非酒精性脂肪肝组织中上调表达。此外,PLIN5的低表达与部分癌症的较差预后相关。综上试验结果,表明脂滴在细胞氧化应激调控过程中发挥了重要作用。它促进微丝骨架重塑而维持细胞形态稳定,通过增强线粒体活性来减少线粒体损伤从而降低ROS水平。脂滴还通过这两种方式降低细胞氧化应激损伤,促进细胞生存。