前言：全身骨骼肌分布广范,在法医学、运动医学和整形医学中骨骼肌挫伤发生率较高。哺乳动物骨骼肌的再生能力已经得到了证实。骨骼肌损伤轻微,肌膜保持完整,可以通过再生恢复其收缩力,而损伤严重,伤及肌膜,则肌纤维再生不完全,形成纤维性修复。纤维性修复与再生这两个过程相互支持、相互制约,共同影响着骨骼肌损伤后恢复的质量。目前研究较多的是骨骼肌损伤后再生过程,但是关于骨骼肌纤维性修复研究报道甚少,所以促使我们寻找一种能够抑制骨骼肌损伤后纤维化的新指标。　　 内源性大麻素系统主要由大麻素受体(cannabinoid receptor,CBR)、内源性大麻素(endocannabinoid)和合成与降解内源性大麻素的酶组成。CBR分为1型大麻素受体(CB1 receptor,CB1R)和2型大麻素受体(CB2 receptor,CB2R)两个亚型。CB2R基因于1993年被克隆,主要分布和表达于免疫系统组织,包括脾、胸腺以及血源性细胞,如淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞等,又称之为周围型大麻素受体(peripheral cannabinoid receptor)。近年来发现CB2R还表达于结肠粘膜固有层中的巨噬细胞、骨骼中的成骨细胞和破骨细胞、中枢神经系统以及人类和啮齿类动物的骨骼肌。　　 CB2R与人类多种疾病的发生和发展有着密切的关系。激活CB2R可以抑制肝损害后纤维化形成,减轻慢性胰腺炎的纤维化程度,而且能够缓解系统性硬化病中皮肤和肺纤维化的发展,并且对心肌缺血再灌注损伤后的心肌具有保护作用。但是CB2R是否参与了骨骼肌挫伤修复的调节,目前国内外尚未见研究报道。　　 本课题在建立了大鼠骨骼肌挫伤动物模型基础上,并实施CB2R选择性激动剂(JWH-133)及拮抗剂(AM630)干预手段,旨在探讨:(1)CB2R表达和肌成纤维细胞数量分别随损伤时间规律性的变化,有可能应用于骨骼肌损伤时间的推断;(2)骨骼肌挫伤修复过程中,CB2R通过调节转化生长因子β1(transforminggrowth factor-β1,TGF-β1),纤维连接蛋白特殊结构域A(fibronectin extra domainA,FN-EIIIA),alpha平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)和基质金属蛋白酶1(matrix metalloproteinases-1,MMP-1)和基质金属蛋白酶2(matrixmetalloproteinases-2,MMP-2)等因子的生物学功能、以及肌成纤维细胞(myofibroblast)的生物学行为,影响骨骼肌挫伤后纤维化程度,揭示内源性大麻素系统中的周围型大麻素受体在骨骼肌挫伤修复过程中的作用。为探索骨骼肌挫伤修复的新机制,进一步阐明骨骼肌挫伤纤维性修复的分子机制奠定基础。为今后在运动医学和整形医学中研究肌肉损伤丌辟新的途径和方法,本研究成果有可能对未来研发相应治疗药物具有重要意义。　　 材料与方法：　　 一、大鼠骨骼肌挫伤模型的建立参照Kami等大鼠骨骼肌急性钝挫伤模型,自制骨骼肌打击器,打击器与传感器相连,通过传感器检测出打击器下落的速度,根据Ek=1/2mv2,计算出动能。应用2％戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉后,右下肢剪毛备皮。并将大鼠右下肢置于伸膝、踝背屈90°位置,用自制打击器(重500克)打击大鼠右下肢距跟骨2.5cm处部位。　　 二、分组及取材健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠65只,体重230g-320g,大鼠以消毒饲料及自来水分笼饲养,保持挚料清洁及空气通畅。　　 (一)骨骼肌挫伤组及对照组　　 1、挫伤组分别于挫伤后不同时间段(3、6、12h、1、3、5、7、10及14d)腹腔注射2％戊巴比妥钠(350mg/kg)麻醉致死后,取右下肢挫伤区肌肉,一部分用于石蜡切片的HE染色、Masson三染色、免疫组织化学染色和免疫荧光染色。另一部分用于Western blot和RT-PCR,每个时间段5只大鼠。　　 2、对照组取5只未致伤正常大鼠右下肢相同部位骨骼肌,其余同上。　　 (二)体内CB2R激动剂组、拮抗剂组及Vehicle组　　 1、CB2R激动剂组分别于挫伤时及伤后1d、3d、5d、7d、9d、11d及13d,于挫伤处肌肉内注射CB2R选择性激动剂JWH-133,按工作液浓度5mg/ml(溶解于DMSO和生理盐水)给药50μl,伤后14d处死大鼠,取右下肢挫伤区肌肉,一部分用于HE染色、Masson染色和免疫组织化学染色。另一部分用于实时荧光定量RT-PCR,共5只大鼠。　　 2、CB2R拮抗剂组分别于挫伤时及伤后1d、3d、5d、7d、9d、11d及13d,于挫伤处肌肉内注射CB2R选择性拮抗剂AM630,按工作液浓度5mg/ml(溶解于DMSO和生理盐水)给药50μl,伤后14d处死大鼠,其余同上。　　 3、Vehicle组挫伤处肌肉内注射溶解于生理盐水的DMS050μl,其余同上。　　 三、组织病理学和免疫组织化学染色骨骼肌样本经4％多聚甲醛(pH7.4)固定1d,脱水、透明,包埋在石蜡中,制作5μm切片,进行HE染色、Masson三染色、免疫组化染色和免疫荧光染色。　　 四、Western blot检测CB2R和GAPDH蛋白提取样本总蛋白,置于-80℃保存。采用Lowry法和BCA法测蛋白浓度,定总蛋白40μg,进行PAGE-SDS凝胶电泳。将蛋白转印到PVDF膜上,用5％脱脂奶粉封闭后,分别用兔抗大鼠CB2R多克隆抗体(1:600)、小鼠抗大鼠GAPDH单克隆抗体(1:1000)4℃孵育过夜,分别再用相应的二抗室温孵育,ECL发光,经电泳凝胶成像分析系统扫描,用Scion Image软件检测蛋白条带CB2R灰度值与GAPDH灰度值,两者比值为其相对蛋白定量。　　 五、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测CB2R和GAPDH mRNA　　 (一)RNA提取用RNAiso Plus提取组织总RNA。紫外可见光分光光度计测定OD260/OD280值,并且计算RNA浓度,将样品部分RNA稀释成0.5μg/μl,-80℃冰箱保存备用。　　 (二)反转录反应表1,反转录反应所需试剂和使用量(三)PCR反应表2,PCR反应所需试剂和使用量(四)电泳6μl PCR反应产物和4μl溴酚兰混合后,加入2％琼脂糖凝胶梳孔内,进行稳压电泳,电泳凝胶成像分析系统扫胶拍照。　　 六、实时荧光定量RT-PCR检测TGF-β1、FN-EIIIA、α-SMA、Col I、Col III、MMP-1、MMP-2和GAPDH mRNA(一)RNA提取同五(二)反转录反应表3,反转录反应所需试剂和使用量(三)Real-Time PCR反应表4,Real-Time PCR反应所需试剂和使用量七、统计学分析用SPSS13.0 for Windows进行数据分析,以P＜0.05为差异,有统计学意义。　　 结果：　　 一、HE染色和Masson三染色　　 (一)大鼠骨骼肌挫伤动物模型挫伤后3h～6h,挫伤处骨骼肌局部出血、水肿、变性,可见少量多核粒细胞(polymorphonuclear cells,PMNs)。伤后12h～1d,大量的PMNs和圆形的单个核细胞(mononuclear cells,MNCs)聚集在挫伤区,并且坏死骨骼肌纤维被逐渐吞噬。伤后3d到7d,PMNs逐渐变少,MNCs和纺锤形的成纤维样细胞(fibroblasticcells,FBCs)大量出现,可见新生血管和胶原形成。同时,新生骨骼肌开始增殖,多个核呈串珠样位于肌细胞中央的多核肌管(multinucleated myotubes)数量逐渐增加,多存在于挫伤中心区。从伤后10d～14d,偶见MNCs,主要是FBCs,纤维化程度进一步加重。挫伤区新生多核肌管多己与损伤周边区肌纤维残存端融合,孤立存在的多核肌管数量减少。Masson染色显示伤后5d～14d胶原纤维面积逐渐增加。　　 (二)大鼠骨骼肌挫伤后局部注射药物动物模型挫伤后14d,CB2R激动剂组挫伤区可见大量核位于中央的新生肌管,密集排列,并可见多个核位于肌细胞周边较成熟新生骨骼肌。FBCs数量比CB2R拮抗剂组和Vehicle组少。CB2R拮抗剂组挫伤区出现大量FBCs,而新生肌管数量比CB2R激动剂组和Vehicle组少。Masson染色显示胶原纤维面积由大到小依次为CB2R拮抗剂组、Vehicle组、CB2R激动剂组。　　 二、免疫组织化学染色　　 (一)大鼠骨骼肌挫伤动物模型CB2R分布于对照组大鼠骨骼肌肌膜、肌浆和血管平滑肌。大鼠骨骼肌挫伤后3h～12h,极少数PMNs微弱表达CB2R。伤后12h～3d,大量MNCs显示了CB2R的阳性反应。伤后3d～7d,CB2R表达于MNCs、FBCs、新生多核肌管和新生血管壁中。伤后10d～14d,仍然可见一些阳性FBCs。　　 Group I(伤后12h～1d),未见α-SMA阳性肌成纤维细胞的分布。GroupⅡ(伤后5d～7d),肌成纤维细胞的数量明显增加。GroupⅢ(伤后10d～14d),肌成纤维细胞的数量达高峰。　　 (二)大鼠骨骼肌挫伤后局部注射药物动物模型与拮抗剂组及Vehicle组相比,大鼠接受JWH-133处理后,挫伤修复区出现的α-SMA阳性肌成纤维细数量明显减少。　　 三、双重免疫荧光染色为了鉴定巨噬细胞和肌成纤维细胞表达CB2R,利用激光共聚焦扫描显微镜分别共定位CB2R和巨噬细胞标志物(Macrophage Marker)以及CB2R和α-SMA。对照组大鼠骨骼肌可见少许CB2R和Macrophage Marker双阳性细胞,伤后1d,挫伤区出现大量表达CB2R和Macrophage Marker细胞。伤后14d,挫伤修复区可见大量CB2R和α-SMA双阳性细胞。　　 四、Western blot检测对照组大鼠骨骼肌有CB2R阳性条带。骨骼肌挫伤各组CB2R蛋白表达强度有一定时间规律性。伤后1d,阳性条带明显增强;伤后5d～7d,达到高峰;伤后10d,开始下降;到伤后14d,CB2R阳性条带仍强于正常对照组。　　 五、RT-PCR检测对照组大鼠骨骼肌可以检测出CB2R mRNA。和western blot趋势相似,伤后7d,CB2R mRNA表达水平达到高峰。　　 六、实时荧光定量RT-PCR检测我们检验JWH-133和AM-630对TGF-β1、FN-EIIIA、α-SMA、ColⅠ、ColⅢ、MMP-1和MMP-2 mRNA表达的影响。AM-630处理后大鼠的TGF-β1、FN-EIIIA、α-SMA、ColⅠ和ColⅢ mRNA含量明显增高。但是,JWH-133处理后大鼠的MMP-1和MMP-2 mRNA表达更多。　　 结论：　　 1、肌成纤维细胞在骨骼肌挫伤区中出现有一定的时间规律性,可以作为一种客观指标用于法医学骨骼肌损伤时间的推断,并且参与了骨骼肌挫伤区内胶原沉积,促进骨骼肌挫伤后纤维化的进程。　　 2、正常大鼠骨骼肌肌膜、肌浆、血管平滑肌细胞和固有的巨噬细胞表达CB2R。　　 3、骨骼肌挫伤修复过程中巨噬细胞和肌成纤维细胞表达CB2R。并且,CB2R表达具有时间规律性,可用于骨骼肌损伤时间的推断。　　 4、CB2R能够有效地减轻骨骼肌挫伤后纤维化程度。　　 5、CB2R可能通过减弱TGF-β1和FN-EIIIA的表达来阻碍肌成纤维细胞活化,从而抑制纤维形成。还可能通过增加MMP-1和MMP-2的表达,降解细胞外基质,促进骨骼肌再生。