第一部分重庆地区2型糖尿病家系成员的代谢特征及代谢综合征患病率分析目的了解重庆地区2型糖尿病(T2DM)家系成员的代谢特征以及代谢综合征(MS)和其亚组分的患病率,寻找可能的遗传标志物。方法(1)选取重庆地区汉族人群中符合入选条件的T2DM家系。共纳入406个家系,1824名研究对象,其中男788名,女1036名。家系组1606名,配偶组218名。研究对象测定人体测量学参数、血压、血脂谱、超敏C-反应蛋白(hsCRP)、非酯化游离脂肪酸(NEFA)等,行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。(2)去除家系组中二级亲属、配偶组中有糖尿病(DM)家族史和患有DM的研究对象,将剩余成员分为T2DM组,无DM的一级亲属(FDR)组和对照组。比较临床和代谢特征,以及MS及亚组分的患病率。(3)将家系成员分成nT2DM组(诊断T2DM时间少于半年,未曾进行过药物治疗),IGT组(患有IGT的一级亲属),FDR-N组(糖耐量正常的一级亲属),Control-N组(糖耐量正常且无DM家族史的配偶),比较各组的临床和代谢特征。结果(1)与对照组比较,FDR组OGTT后2h血糖、Homa-IR1和TG显著增加(P﹤0.05),HDL-C显著减低(P﹤0.05)。DI指数有减低的趋势,但无统计学差异(P﹥0.05)。IGR、肥胖、腹型肥胖、高TG血症、低HDL-C血症、高血压和MS在FDR组分别为34.3%、32.2%、33.1%、29.8%、28.9%、12.5%和23.5%,除高血压的患病率略低于对照组外,其他各项均高于对照组。FDR组患IGR的风险是对照组的2.39倍(P﹤0.01),患低HDL-C血症的风险是1.87倍(P﹤0.05),患MS风险是2.3倍(P﹤0.05)。(2)T2DM组患者的代谢紊乱更加严重。患肥胖、高TG血症、低HDL-C血症和高血压的风险约为对照组的2.5倍(OR值分别为2.73、2.53、2.46和2.81,P﹤0.01),患腹型肥胖的风险4倍左右(OR值为3.81, P﹤0.01),患MS风险是7倍(OR值为7.02,P﹤0.01)。(3)与Control-N组比较,FDR-N组hsCRP、TG和Homa-IR升高(P﹤0.05),HDL-C降低(P﹤0.05),NEFA有增高的趋势。NEFA和hsCRP在nT2DM组和IGT组显著增加(P﹤0.05)。结论T2DM家系中非糖尿病一级亲属已表现出不同程度的代谢紊乱。T2DM家系的家族聚集性不仅表现为高血糖的聚集性,还表现为肥胖、高血压、脂代谢紊乱等MS亚组分的聚集性。TG、HDL-C、Homa-IR和炎性因子hsCRP、NEFA的变化可能与遗传因素有关。第二部分血清双向凝胶电泳-质谱技术的建立与优化目的建立和优化血清双向凝胶电泳-质谱技术。方法应用ProteoExtract Albumin/IgG Removal Kit纯化血清蛋白,去除白蛋白和IgG;采用固相pH梯度(IPG)、等电聚焦(IEF)为第一向、SDS-PAGE垂直电泳为第二向的双向凝胶电泳(2-DE)和质谱技术分析评价血清蛋白纯化效果,同时对标本预处理、等电聚焦和银染等方面进行了优化。结果去除白蛋白(ALB)和IgG的预处理使血清2-DE图谱的局部分辨率提高,同时由于上样量的增加,有利于一些含量较低蛋白的质谱鉴定。对标本预处理、等电聚焦和银染等方面进行了优化,建立了稳定的、重复性较好,分辨率较高的血清双向凝胶电泳-质谱技术。结论本研究成功建立和优化了血清蛋白质的双向凝胶电泳-质谱技术,为寻找疾病的血清学标志物奠定了基础。第三部分应用双向电泳-质谱技术筛选与2型糖尿病家系相关血清蛋白质目的以2型糖尿病家系为基础,运用双向凝胶电泳技术寻找2型糖尿病家系的血清蛋白表达谱差异,并结合肽质量指纹谱技术和蛋白质印迹鉴定差异蛋白质,阐明差异蛋白与2型糖尿病发生发展的关系,寻找2型糖尿病的遗传标志。方法(1)从重庆地区符合入选条件的汉族T2DM家系中选择受试对象,分为四组:nT2DM组(诊断T2DM时间少于半年,未曾进行过药物治疗,男30例/女30例)、IGT组(男15例/女15例)、糖耐量正常的一级亲属组(FDR-N)(男30例/女30例)和糖耐量正常的无DM家族史配偶(Cnotrol-N)(男23例/女27例)为对照组。将每组的血清等体积混合上样,然后随机从每组选取4个样本重复双向电泳进行验证,运用PDQuest7.3.1软件比较各组的2-DE图,获得差异蛋白点。(2)将差异蛋白点取出、酶解后,进行质谱鉴定,得到肽质量指纹图(PMF),然后采用Mascot和MS-Fit软件进行数据检索,找到差异蛋白。(3)收集nT2DM、IGT、FDR-N和Control-N正常对照组各10例病人,进行差异蛋白质的蛋白质印迹验证。结果(1)获得了重复性较好的的四组2-DE图谱。(2)通过PDQuest软件比较四组的2-DE图谱,得到了32个差异蛋白点。在nT2DM、IGT、FDR-N高表达的有13个,仅在nT2DM和IGT组高表达的蛋白点有11个,仅在nT2DM和IGT组低表达的蛋白点有2个,仅在nT2DM组高表达蛋白点有3个,仅在nT2DM组表达的蛋白点有1个,在nT2DM组高表达,在IGT组低表达的有1个,对照组缺失的1个。(3)对全部的差异点进行质谱鉴定,其中,27个蛋白点鉴定出9个蛋白,5个蛋白点未鉴定出。鉴定出的蛋白分别是C反应蛋白、补体C3、补体C4b结合蛋白、结合珠蛋白、转甲状腺素蛋白、视黄醇结合蛋白、ApoM、ApoAⅣ和ApoE。(3)选择候选蛋白ApoM进行蛋白质印迹,ApoM在各组中的无显著性的变化。结论(1)首次运用双向电泳技术-质谱技术寻找2型糖尿病家系的血清蛋白表达谱差异,获得了9个差异蛋白,分别是C反应蛋白、补体C3、补体C4b结合蛋白、结合珠蛋白、转甲状腺素蛋白、视黄醇结合蛋白、ApoM、ApoAⅣ和ApoE。(2)蛋白质组学和蛋白质印迹仅仅是初步的蛋白质水平上的研究,ApoM与其他蛋白质在T2DM家系中的变化还需要进一步的确定。(3)这些蛋白在T2DM家系成员中的高表达,可能与T2DM家系的遗传密切相关,可能是T2DM家系的遗传标志物。但是这些蛋白质的变化还存在于肥胖、高血压、高脂血症和冠心病等疾病中,这些蛋白质是否能成为T2DM家系的遗传标志物还需要进一步的研究。