睾丸支持细胞（Sertoli Cells, SCs）及其结构是由意大利组织学家EnricoSertoli于1865年首先进行描述的。支持细胞的结构完整性保证了精子发生的正常进行，在曲细精管中，各级生精细胞镶嵌在支持细胞上，为生精细胞提供支架。同时，支持细胞能够分泌类固醇类、激素类、调节蛋白类、生长因子类、旁分泌因子、转运蛋白类等为生精细胞分化成熟提供稳定的环境及必须的能量物质，保证精子正常有序的发生。近年来研究已经证实支持细胞分泌FasL是其免疫豁免的重要基础。临床上，已经利用睾丸支持细胞免疫豁免的功能进行了对人类神经退行性疾病的治疗。近年有学者已成功证实将睾丸支持细胞作为饲养层能够显著促进多种干细胞的增殖。因此支持细胞已成为细胞培养技术、组织工程及器官移植等领域的研究热点之一，在临床移植领域具有广阔的应用前景。淫羊藿苷（Icariin, ICA）来源于天然植物，是中药淫羊藿（Epimediumbrevicornum Maxim）的主要活性成分，它是一种安全、有效、经济的天然植物。现代药理研究表明，ICA能够促进生殖系统的发育与成熟、保护心脑血管系统、促进造骨细胞的增殖和分化、提高免疫功能及具有抗癌的作用，然而其部分作用机制尚不明确。所以本研究旨在观察ICA对SCs体外增殖的影响，并进一步探讨ICA可能促进SCs体外增殖的保护作用。故研究SCs体外培养及其增殖具有重要的临床意义。本实验分为三部分：第一部分：原代大鼠睾丸支持细胞的分离、纯化、培养及鉴定研究目的：分离培养活力及纯度较高的原代睾丸支持细胞（SCs）。研究方法：选取8-9天的SD大鼠，采用两步酶法分离并进行睾丸支持细胞的原代培养，48h后，用PH值7.4Tris-HCL低渗去除污染的间质细胞。用台盼蓝染色检测细胞的存活力。利用免疫荧光检测睾丸支持细胞特异性分泌的雄激素结合蛋白（androgen binding protein，ABP）及结晶紫染色观察细胞形态进行细胞鉴定。研究结果：通过台盼蓝染色检测细胞活力和活细胞形态学彩图，显示两步酶法获取的睾丸支持细胞的活力达95%以上。经免疫荧光染色及结晶紫染色观察细胞的形态，获取的睾丸支持细胞48h之后纯度达到95%以上。研究结论：1、两步酶法分离培养原代睾丸支持细胞步骤更加简单，污染的其他生殖细胞数量更少。2、通过镜下观察、结晶紫染色及免疫荧光鉴定，证实两步酶法获取的原代睾丸支持细胞纯度以及细胞活力均达95%以上。第二部分淫羊藿苷对大鼠睾丸支持细胞体外增殖的影响研究目的：用MTT法、流式细胞术、直接细胞计数方法检测淫羊藿苷对睾丸支持细胞体外增殖的影响。研究方法：采用MTT法检测ICA对睾丸支持细胞体外增殖的作用，并确定ICA的有效剂量和作用时间。分别用0μM,5μM,10μM,15μM,20μM及25μM不同浓度ICA对SCs处理24h，以及根据已确定有效剂量10μM作用于SCs0h,6h,12h,24h及48h不同时间点，采用MTT法，在酶标仪下检测每孔光密度值来观察经药物作用后睾丸支持细胞的活力；为了避免MTT法的不足，我们采用血小板直接计数不同剂量ICA处理24h后以及10μM处理的不同时间点的48孔板中SCs的数量，此方法比MTT更加精确，误差更小，但较MTT繁琐；为了避免MTT以及直接细胞计数的误差，多种检测方法互相印证，我们又采用荧光标记物CFSE标记培养于六孔板中的SCs，SCs的处理条件同MTT及细胞计数，然后用流式细胞仪检测每组细胞的荧光强度，随着细胞增殖，整合至细胞中的CFSE平均分配于子代细胞中，荧光强度也逐渐减弱，利用这一特点可观察细胞的增殖能力。研究结果：通过MTT、直接细胞计数以及荧光强度的检测，观察ICA对SCs的增殖的影响，我们发现与空白对照组比较，ICA5μM组细胞光密度值、细胞数量及荧光强度无明显变化（p﹥0.05），ICA10μM,15μM，20μM及25μM各组细胞生长光密度值及细胞数量明显增高，荧光强度显著减弱（p﹤0.05）。ICA10μM处理的SCs随着时间的延长增殖明显增加，24h及48h时间点SCs光密度值及细胞数量明显增高，荧光强度明显减弱（p﹤0.05）。研究结论：以上各种方法证明，ICA能够显著促进SCs的体外增殖，并且呈现时间及剂量依赖性。第三部分：淫羊藿苷促进大鼠睾丸支持细胞体外增殖的机制研究研究目的：探讨淫羊藿苷促进睾丸支持细胞体外增殖作用的机制。研究方法：MAPKs，丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）是存在于大多数细胞内的一类丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶。其主要作用是将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内，并引起细胞相应的生物学反应，如细胞增殖、分化、转化及凋亡等。截至目前，在哺乳类细胞已发现存在着下述三条并行的MAPKs信号通路，即ERK、JNK及p38信号通路，研究证实，ERK信号通路主要参与细胞增殖与分化的调控，而JNK及p38主要参与氧化应激、炎症与细胞凋亡等的调控。因此在实验中，我们分别将细胞分为空白对照组、ICA组（只加药）、UO126组、UO126+ICA、SP600125组、SP600125+ICA、SB203580组及SB203580+ICA组，用以上三种信号通路的特异性阻断剂，即ERK阻断剂UO126、JNK阻断剂SP600125、p38的阻断剂SB203580分别预处理SCs之后加入10μM浓度的ICA作用24h后，用MTT检测各组细胞的光密度值、细胞计数及流式细胞仪检测各组荧光强度。根据上述实验结果，选择对细胞增殖有影响的阻断剂作用于细胞，处理SCs24h后，提取各组细胞蛋白，用Western blot检测各组细胞中磷酸化ERK1/2及总ERK1/2的表达水平。研究结果：MTT检测各组光密度值显示，与空白对照组相比，ICA组（只加药）光密度值明显增加(p﹤0.05)，UO126与UO126+ICA组光密度值显著低于空白对照组(p﹤0.05)，其余各组与空白对照组之间以及各组之间无明显差异（p﹥0.05）；直接细胞计数显示ICA组（只加药）细胞数量明显高于其他各组(p﹤0.05)，UO126与UO126+ICA组细胞数量显著低于其余各组，SP600125组、SP600125+ICA、SB203580组及SB203580+ICA组与空白对照组之间无明显差异（p﹥0.05）；流式细胞仪检测各组荧光强度显示结果与MTT及细胞计数结果一致；因此，根据上述实验结果我们用Western blot方法检测p-ERK1/2及ERK1/2的表达水平显示，p-ERK1/2的表达随着ICA的剂量增加及时间的延长而增强，加入ERK1/2信号通路的阻断剂UO126之后，与空白对照组及ICA组相比较，只有UO126与UO126+ICA组p-ERK1/2的表达受到显著抑制(p﹤0.05)，ICA组p-ERK1/2显著高于其余各组(p﹤0.05)。研究结论：1、ERK阻断剂UO126能够明显阻断ICA对SCs促进增殖的作用，而JNK及p38阻断剂不能抑制ICA对SCs促进增殖的作用。2、ICA能够显著提高SCs中p-ERK1/2水平的表达，并于ICA的剂量和作用时间呈正相关，提示ERK1/2信号通路是ICA促进SCs体外增殖的可能信号通路。