【摘 要】
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病原微生物感染引起的各类疾病是畜禽生产面临的重大挑战之一,研究免疫系统在细菌感染过程中的调节机制对于抵抗细菌入侵,保证存活率,提高畜牧生产至关重要。内毒素脂多糖（LPS）是建立系统性炎症模型最常用的天然诱导剂之一,在机体中注射LPS能诱导机体产生与革兰氏阴性菌入侵时相类似的病理反应。机体在遭遇细菌入侵时会迅速激活免疫系统分泌细胞因子,但对于机体如何精准调节病理状态下的免疫平衡在一定程度上还是未知的
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病原微生物感染引起的各类疾病是畜禽生产面临的重大挑战之一,研究免疫系统在细菌感染过程中的调节机制对于抵抗细菌入侵,保证存活率,提高畜牧生产至关重要。内毒素脂多糖（LPS）是建立系统性炎症模型最常用的天然诱导剂之一,在机体中注射LPS能诱导机体产生与革兰氏阴性菌入侵时相类似的病理反应。机体在遭遇细菌入侵时会迅速激活免疫系统分泌细胞因子,但对于机体如何精准调节病理状态下的免疫平衡在一定程度上还是未知的。神经系统和免疫系统是两个相对独立的系统,有着各自的结构和功能,但同时这两者之间也存在着密切的互作关系。免疫细胞在体内外均会响应神经递质或神经肽的刺激,同时神经细胞也受到多种免疫因子的调控。这两者的相互作用在维持机体稳态中发挥着关键作用,对于这两大系统的互作机制研究可能能为机体抵抗病原感染提高存活率提供新的治疗思路与诊疗手段。本研究旨在利用神经生物学与分子生物学的各种技术手段,针对肾上-腹腔神经节支配脾的神经免疫环路,观察肾上-腹腔神经节在细菌入侵时发生的变化并找到能特异调节脾免疫反应的神经递质。同时,解析肾上-腹腔神经节中特定类型神经元对脾免疫反应的调控机制,寻找能响应肾上-腹腔神经节神经元信号的免疫细胞及分子细胞通路。以上研究将为探索机体遭遇病原入侵时,外周神经系统精准快速调控机体免疫反应提供新的理论基础。本研究的主要内容分为以下几个部分:1.肾上-腹腔神经节神经元响应LPS并上调NPY表达首先将伪狂犬病毒注射到大鼠脾中逆行追踪验证脾的神经支配来源于肾上-腹腔神经节。肾上-腹腔神经节的转录组测序（RNA-seq）发现大鼠肾上-腹腔神经节中含有丰富的神经肽Y（NPY）,在肾上-腹腔神经节神经递质中NPY也是对LPS响应变化最大的基因。随后通过钙成像实验发现肾上-腹腔神经节神经元能被LPS直接激活,免疫荧光共染发现存在肾上-腹腔神经节NPY+神经元表达LPS的受体TLR4。以上结果证明LPS可以直接导致肾上-腹腔神经节神经元的激活并上调其中NPY的表达水平,这一过程可能在脾免疫反应调控中发挥重要作用。2.肾上-腹腔神经节NPY生理状态下对脾的免疫调节作用通过构建具有敲降NPY功能的腺相关病毒可以进一步研究肾上-腹腔神经节神经元分泌的NPY对脾的具体调节作用。生理状态下肾上-腹腔神经节神经元NPY水平被敲降后,脾中B细胞、T细胞和巨噬细胞的功能均发生了变化。通过单细胞转录组测序（sc RNA-seq）和免疫荧光染色发现:T细胞和巨噬细胞上含有丰富的NPY受体NPY1R,而B细胞上则几乎没有该受体。随后通过KEGG分析发现NPY可抑制巨噬细胞TNF信号通路,并减少巨噬细胞中相应细胞因子如IL-1β、TNF-α的表达。3.肾上-腹腔神经节NPY抑制LPS及细菌感染引起的脾炎症反应为研究炎症模型下NPY的调控作用,通过体外NPY刺激脾细胞,肾上-腹腔神经节神经元与脾细胞共培养,体内肾上-腹腔神经节神经元NPY敲降及过表达等实验,发现LPS诱导的大鼠炎症模型中肾上-腹腔神经节神经元NPY有抑制脾脏中炎症因子风暴的功能。在大肠杆菌感染模型中,敲降NPY水平会导致大鼠死亡率显著上升,进一步证明肾上-腹腔神经节中NPY可抑制细菌感染引起的炎症风暴从而降低死亡率。4.果蝇NPF调节细菌感染引起炎症反应通过果蝇神经元NPF敲降品系的构建及果蝇细菌感染等实验发现果蝇神经元NPF（NPY同源物）水平被敲低后,果蝇在细菌感染模型下产生的抗菌肽及细胞因子水平显著上升,并且果蝇的死亡率显著升高,这一结果与大鼠肾上-腹腔神经节NPY被敲低后的结果类似。以上结果表明NPY/F对机体免疫系统的调控是相对保守的,在不同物种中均存在神经系统与免疫系统的互作,而神经肽（如NPY等）则是两者进行交流的语言之一。综上所述,本课题揭示了神经来源的NPY/F在不同物种中均为神经系统和免疫系统进行交流的语言之一,且其调控功能在果蝇与大鼠中是相对保守的。大鼠肾上-腹腔神经节神经元能够感知病原感染并大量上调NPY表达水平来抑制脾中炎症因子的表达,从而精确调节脾的免疫应答能力。本研究可能为缓解细菌感染导致的炎症风暴和调节免疫平衡提供新治疗策略和药物靶点。
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