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日本脑炎(Japanese encephalitis, JE)又称流行性乙脑脑炎,简称乙脑,是由日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)感染所引发的一种人畜共患病。JEV属于黄病毒科黄病毒属,在自然条件下主要通过蚊虫传播。猪被认为是JEV最重要的自然增殖动物,在乙脑的传播中起到重要作用。猪乙型脑炎病毒存在于东南亚地区并在大多数猪场流行,严重威胁人畜健康。2’-5’寡腺苷合成酶(2’-5’ oligoadenylate synthetases,OAS)是干扰素(Interferon，IFN)诱导产生的抗病毒蛋白,是哺乳动物先天性免疫系统的重要成分。细胞内的OAS/RNaseL信号通路在宿主控制黄病毒、呼肠孤病毒和脑心肌炎病毒的先天性免疫反应中起重要作用。近年来已有研究证实OAS存在不依赖于RNase L途径的抗病毒作用。自发现小鼠mOAS1b基因为WNV的风险标志基因以来,已报道OAS具有抑制脑心肌炎病毒(EMCV)、水疱性口炎病毒(VSV)等多种病毒增殖的作用。人的OAS基因已被证实与西尼罗病毒(WNV)、丙型肝炎病毒(HCV)和SARS冠状病毒的易感性有关。小鼠、马和人中均发现OAS基因是抗黄病毒感染的生物标志基因,猪源与人源OAS1蛋白的氨基酸同源性为73%,具有相似的酶学特征,因此进一步研究猪OAS基因是否就是猪感染厄V致病的风险标志基因是必要的。本研究通过细胞内瞬时转染pOAS1a、pOAS1b、pOAS2和pOASL质粒,分析比较胞内pOAS基因家族抗JEV感染的作用。通过分析自然感染JEV发病猪和健康猪OAS1编码区外显子基因序列的差异,研究猪OAS1单核甘酸多态性(SNP)与猪感染JEV发病表型的相关性,揭示OAS是否为猪感染JEV的风险标志基因。本研究主要从以下几个方面展开。1.猪源OAS2多抗的制备根据Genbank中报道的猪源OAS2的基因序列,设计特异性OAS2引物,通过RT-PCR方法从PK-15细胞中扩增出长度为2124bp的猪源OAS2基因。将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,经双酶切和测序鉴定正确后,将重组质粒转入大肠杆菌Rosseta2 (DE3)中,IPTG诱导表达。SDA-PAGE结果显示获得大小为70KD的OAS2表达产物和,以包涵体形式存在。通过直接切胶法纯化这种蛋白。将纯化后的OAS2蛋白免疫兔子,获得多抗血清。Western blot结果显示抗血清与蛋白相互作用后有明显的特异性条带。该研究为猪源OAS2蛋白抗病毒的研究与机制研究奠定了基础。2.比较猪源OAS抗JEV感染的研究本实验研究了猪α干扰素对JEV增殖和猪源OAS表达量变化的影响,以及KEV强毒株刺激PK-15细胞后猪源OAS表达量的变化。结果显示：猪a干扰素在PK-15细胞上有明显抑制JEV增殖的作用,并可诱导猪源OAS基因家族表达量的显著提高。JEV强毒株刺激PK-15细胞24h,猪源OAS表达量均有所上升,但不如干扰素和JEV共同作用细胞表达量上升明显。本试验成功构建了pFlag-pOAS1b 和 pcDNA-pOAS2真核表达载体,与实验室保存的pFlag-pOAS1a、pFlag-pOASL质粒瞬时转染PK-15细胞,通过质粒过表达研究其对JEV增殖的影响。研究发现pFlag-pOAS1a、 pcDNA-pOAS2 和 pFlag-pOASL有明显抑制JEV增殖的作用,且pFlag-pOAS1a 和 pFlag-pOASL的作用强于 pcDNA-pOAS2,而pFlag-pOASlb并没有明显的抑制作用。表明猪源OAS基因家族存在胞内抗JEV作用,为下一步探究其抗病毒作用信号通路奠定基础。3.猪源OAS1编码区SNP分析本研究根据猪OAS1外显子序列,分析比对了pOAS1a和pOAS1b外显子位点,发现pOAS1a与pOAS1b外显子1-4核酸水平同源性高达96.9%,外显子5-6为66.5%,显示出pOAS1对外显子5和6的选择性剪接作用形成了pOAS1的两个亚型。对收集的乙脑发病猪、健康猪、不同品系的猪OAS1编码区外显子1-6进行了SNP检测,发现pOAS1a外显子1-6存在22个SNP位点,pOAS1b外显子1-6存在28个SNP位点。比较乙脑发病猪和健康猪序列发现pOAS1a第114位(A→T)存在差异较大,发病猪突变率高。通过蛋白质结构研究发现,此位点为OAS与RNA结合活化作用位点,这一位点的突变将影响OAS蛋白的活化。此位点的发现为寻找猪群感染JEV的易感标志基因奠定基础。