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目的本研究在构建肥胖伴骨髓腔前列腺癌(Prostate Cancer,PCa)荷瘤裸鼠模型的基础上,明确肥胖状态下游离脂肪酸(Free Fatty Acid,FFA)含量增加,是否会引起骨髓微环境改变(脂肪细胞增多,增加环氧合酶2(Cyclooxygenase 2,COX2)的表达,成骨细胞减少,降低骨保护素(Osteoprotegerin,OPG)的表达),是否会促进PCa细胞在骨髓腔中的生长和定殖,并明确二者的相关性;在体外培养人源骨髓间充质干细胞(human Marrow Mesenchymal Stem Cells,h MSCs)的基础上,明确高浓度FFA(辛酸)对h MSCs向脂肪细胞、成骨细胞分化的影响,以及对分化关键因子表达的影响;将辛酸(FFA C8:0)联合诱导剂诱导分化成熟的脂肪细胞、成骨细胞分别与人前列腺癌细胞PC3及22RV1间接共培养,明确辛酸(FFA C8:0)对PCa细胞生物学行为的影响。通过以上研究,尝试阐明肥胖相关PCa发生骨转移的可能分子机制,为临床治疗提供新的分子靶标。方法(1)在石河子大学医学院第一附属医院泌尿外科,采集非癌个体(n=16)前列腺癌无骨转移患者(n=8)和前列腺癌骨转移患者(n=8)血清样本,以及收集患者一般资料及各项生化指标。在此基础上,利用高效液相色谱-质谱(LC-MS)检测受试者血清游离脂肪酸谱。(2)构建骨髓腔PCa荷瘤裸鼠模型,分为普通饮食组(n=4)和高脂饮食组(n=8),试剂盒检测血清中总胆固醇(Total Cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、高密度脂蛋白(High-density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL)、游离脂肪酸(Free fatty acid,FFA)的含量;H&E染色检测两组裸鼠骨髓腔中脂肪细胞、成骨细胞面积及数目,免疫组织化学法检测COX2、OPG等因子表达水平。(3)体外培养h MSCs和前列腺癌细胞(PC-3/22RV1),将辛酸(FFA C8:0)联合诱导剂作用于h MSCs向脂肪细胞方向诱导。油红O染色法鉴定大量脂滴红染且饱满,说明脂肪细胞诱导成功;将辛酸(FFA C8:0)联合诱导剂诱导人骨髓间充质干细胞(h MSCs)向成骨细胞方向,茜素红染色法鉴定深红色钙结节形成,说明成熟成骨细胞诱导成功;此外运用q RT-PCR和Western Blot技术检测成熟的脂肪细胞、成骨细胞中COX2、脂联素(Adiponectin,APN)、OPG、Runt相关转录因2(Runt-related Transcription Factor2,RUNX2)的m RNA和蛋白表达水平,ELISA试剂盒检测上清液中前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)及OPG的含量。(4)收集辛酸(FFA C8:0)联合诱导剂诱导成熟的脂肪细胞和成骨细胞的上清液分别与前列腺癌细胞(PC-3/22RV1)间接共培养,运用CCK-8、Transwell技术检测对PC-3/22RV1细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响;辛酸(FFA C8:0)联合诱导剂诱导成熟的脂肪细胞和成骨细胞的上清液分别用来直接刺激前列腺癌细胞(PC-3/22RV1)48h,检测前列腺癌细胞中波形纤维蛋白(Vimentin)、基质金属肽酶2(Matrix Metallopeptidase 2)等增殖侵袭相关因子的表达。(5)应用SPSS 20.0软件对数据分析。数据分析采用数据正态分布使用t检验、非正态分布数据使用秩和检验、多组间相互比较采用单因素方差分析(ANOVE)。P<0.05认为差异具有统计学意义。结果1.PCa患者血清中FFA含量测定及骨转移特异性相关的FFA筛选(1)PCa骨转移患者血清FFA含量显著高于无骨转移患者及非癌个体(P<0.05);(2)筛选出辛酸(FFA C8:0)在PCa患者血清中含量显著升高(P<0.05)。2.构建肥胖伴骨髓腔前列腺癌荷瘤裸鼠模型,并检测一般指标。(1)高脂喂养组骨髓腔PCa荷瘤裸鼠模型的成瘤率及肿瘤大小显著高于普通喂养组裸鼠(P<0.05);(2)高脂喂养组骨髓腔PCa荷瘤裸鼠血清样本中TG、HDL、LDL、GLU和FFA含量显著高于普通喂养组裸鼠(P<0.05);(3)H&E染色结果显示:与普通喂养组相比,高脂喂养组裸鼠骨髓腔中脂肪细胞面积占总面积的百分比及脂肪细胞的数量均显著升高(P<0.001),成骨细胞面积占总面积的百分比及成骨细胞的数量均显著降低(P<0.001);(4)免疫组织化学法结果提示:与普通喂养组相比,高脂喂养组裸鼠骨髓腔中COX2的m RNA及蛋白表达水平均显著升高(P<0.05),OPG的m RNA及蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。3.辛酸(FFA C8:0)联合诱导剂诱导h MSCs分化成更多脂肪细胞,减少向成骨细胞的分化及相关基因的表达。(1)100μM辛酸(FFA C8:0)联合诱导剂作用于h MSCs向脂肪细胞方向诱导,并诱导分化为成熟的脂肪细胞,油红O染色法鉴定大量脂滴红染且饱满,说明诱导成功;与NC组相比,辛酸(FFA C8:0)诱导组脂肪细胞的面积及数目均显著升高,COX2的m RNA及蛋白表达水平及脂肪细胞上清液中PGE2的含量均显著增加,而APN的m RNA及蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。(2)100μM辛酸(FFA C8:0)联合诱导剂作用于h MSCs向成骨细胞方向诱导,并诱导分化为成熟的成骨细胞,茜素红染色法鉴定深红色钙结节形成,说明诱导成功;与对照组相比,成骨细胞的钙结节数目显著降低(P<0.01),OPG、RUNX2的m RNA及蛋白表达水平均显著降低(P<0.01),而细胞上清液中OPG的含量无显著差异(P>0.05)。4.脂肪细胞与成骨细胞的上清液分别与前列腺癌细胞间接共培养,检测其增殖、侵袭、迁移能力及下游因子的表达。(1)100μM辛酸(FFA C8:0)联合诱导剂诱导成熟的脂肪细胞,取上清液与前列腺癌细胞PC-3/22RV1间接共培养48h后,CCK8,Transwell结果显示:与NC组相比,辛酸(FFA C8:0)处理组前列腺癌细胞增殖能力无显著变化,但侵袭和迁移能力显著增加(P<0.05);上清液刺激前列腺癌细胞(PC-3/22RV1)48h后,运用q RT-PCR技术检测发现:前列腺癌细胞中Vimentin、MMP2的m RNA水平均显著升高(P<0.05)。(2)100μM辛酸(FFA C8:0)联合诱导剂诱导成熟的成骨细胞,取上清液与前列腺癌细胞PC-3/22RV1间接共培养48h后,CCK8,Transwell结果显示:与NC组相比,辛酸(FFA C8:0)处理组前列腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力均无显著变化(P>0.05)。结论1.辛酸(FFA C8:0)可通过促进骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化成熟,同时抑制骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化成熟,使骨髓微环境发生改变。2.辛酸(FFA C8:0)可能通过增加骨髓腔中脂肪细胞含量,使COX2表达增加促进前列腺癌骨转移。